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红豆杉细胞组织培养等相关技术的综述

摘要红豆杉因其次生代谢产物紫杉醇具有独特的抗癌活性，而倍受关注[1，2]，目前研究较多的是用细胞组织培养技术生产红豆杉获取紫杉醇，而且研究者对其相关技术条件进行了不断的摸索与优化，本文主要对近10年的红豆杉细胞组织培养技术相关内容进行综述。

关键词红豆杉；紫杉醇；细胞培养；优化

1、介绍

红豆杉是红豆杉科红豆杉属植物，是第四世纪冰川后迄今为止仅有的56种植物中的珍稀药用树种之一。全世界共14种，我国有4种和1变种，即东北红豆杉、云南红豆杉、西藏红豆杉、中国红豆杉和南方红豆杉[1]。红豆杉产生的二萜类次生代谢产物-紫杉醇是当今世界公认的广谱、高活性抗癌药物，具有独特的抗癌机理，因此红豆杉倍受关注[1，2]。

紫杉醇对卵巢癌、子宫癌、乳腺癌等十几种癌症具有很好的疗效，它目前已在临床上作为乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌的一线用药[3]。但天然红豆杉树皮中紫杉醇含量极低，仅为干重的0．01％一0．06％，3～6棵100年左右的红豆杉树皮才能提取出用于治疗一个癌症病人所需求的紫杉醇[4]，由此也出现了药用和资源保护的尖锐矛盾[5]，可见单纯靠天然生长的红豆杉树中提取的紫杉醇远远不能满足需求，药源不足已成为限制紫杉醇在临床中大量应用的瓶颈[3，4]。

解决药源的问题的方法说来应该就两个大方面，即人工合成和生物技术方法，也就是化学合成和利用相关生物技术解决紫杉醇的药源问题。但是，由于紫杉醇化学结构的复杂性，这就意味着紫杉醇的化学合成在经济上是不可行的；而且紫杉醇的半合成原料，例如从针叶红豆杉所分离得到的巴卡亭Ⅲ，也要从红豆杉属植物中提取获得[6]。这样看来，人工合成的方法，不论是全化学合成还是半化学合成，其可行性都很低。

从生物技术角度来看，人们主要从遗传转化、人工栽培、真菌生产和植物细胞培养等几个方面尝试解决紫杉醇的药源问题，而其中的细胞培养因具有众多优点而成为商业化生产的首选方法[5]。本文主要从红豆杉细胞组织培养等生物技术角度，对近10年其培养过程、培养条件及其优化等方面进行综述。

2、红豆杉细胞培养技术

红豆杉细胞培养的首要考虑应该是外植体的选择，这是对紫杉醇的产生具有质的影响的关键因素。此外还得考虑培养基及培养条件和方式等的影响，下面就从红豆杉细胞培养技术的一般过程加以说明。

外植体的选择

红豆杉为裸子植物，不同种的红豆杉或不同的器官、组织、生长部位等外植体的诱导能力不尽相同，所需的培养基及培养条件有很大的差异，其愈伤组织诱导比较困难，生长也较缓慢[4，5]。

现在，人们已从各种不同的红豆杉的不同外植体如针叶、幼茎、树皮、形成层、种胚及假种皮等诱导出愈伤组织，其中以幼茎为最好的来源[5]。但是，对于不同种属的红豆杉则有不同优选的外植体，如东北红豆杉幼茎、短叶红豆杉的树皮或形成层则分别是最佳的外植体[4]。另有实验发现，以紫杉醇含量高的外植体作为诱导材料，可获得紫杉醇产量高的细胞系。云南红豆杉和中国红豆杉愈伤组织中紫杉醇含量较高，是获得紫杉醇高产愈伤组织系的外植体的较佳来源［3］。

培养基的选择

对于红豆杉愈伤组织的诱导与培养，多数报道的适宜培养基为基本的或经改良的B5培养基，然而也有不同的研究结果报道。翟雪霞[7]等通过研究比较三种不同的培养基，表明以太行山原始中国红豆杉的1-2年生嫩枝和幼叶为外植体材料时，B5培养基的诱导效果最好，其具有诱导率高，出愈时间早，愈伤组织块大，色浅，质地疏松和生长快等优点，在后续培养中发现其是建立细胞系的质量最好的类型。而MS和WPS培养基诱导出的愈伤组织颜色较深，生长较慢，但质地致密，有胚性化趋向。另有研究[3]以南方红豆杉芽为外植体时，发现最适诱导的培养基为MS；对愈伤组织的增殖、驯化和紫杉醇的积累则以B5为最佳。也有南方红豆杉愈伤组织在TA培养基上生长明显优于B5培养基的报道[3]。

由此可见，对于来源不同甚至相同的红豆杉，其外植体其最适培养基必须亲自经过多次的摸索研究方能定夺，前人的研究成果只能作为参考依据。另外由于培养基中激素、激素的浓度及激素之间的组合对愈伤组织的诱导和培养及紫杉醇的合成与积累起着重要作用[3，8]，故而培养基中还需加入比例合适的各种激素。

培养方式和条件的确定

培养过程涉及植物组织的脱分化、愈伤组织的诱导及继代与细胞悬浮培养[9，10]等。

愈伤组织的诱导黑暗条件有利于愈伤组织的诱导、生长和紫杉醇的形成，紫杉醇的产量高于光照条件下的3倍[3，7]。培养方式一般为固体培养，也有研究者为了缩短从诱导到悬浮培养的生长周期而采用液体悬浮培养[5，10]。

愈伤组织继代与细胞悬浮培养翟雪霞[7]等研究中国红豆杉时，发现液体培养、半固体培养和纸桥培养等3种培养方式的细胞生长率差异显著，其中以纸桥培养的生长率最高，认为纸桥培