生物物理技术等温微量量热法.ppt

第31页，共51页，星期日，2025年，2月5日第32页，共51页，星期日，2025年，2月5日三.ITC方法的应用蛋白质-蛋白质相互作用：抗原-抗体相互作用，分子伴侣-底物相互作用，等等。蛋白质-小分子相互作用，酶-抑制剂相互作用蛋白质-核酸相互作用核酸-核酸相互作用核酸-小分子相互作用生物分子-细胞相互作用DNA/RNA-药物相互作用酶促反应动力学蛋白质折叠/去折叠RNA折叠第33页，共51页，星期日，2025年，2月5日1.研究Ras，Cdc42与底物（effector）的结合ThermodynamicsofRas/EffectorandCdc42/EffectorInteractionsProbedbyIsothermalTitrationCalorimetryHerrmannC.,J.Biol.Chem.276:23914-23921(2001).Ras是一种在信号传导过程中起重要作用的蛋白质，可以向其下游的许多信号传导途径输送细胞内调控信号。Ras在非激活态与GDP结合，当GDP被GTP取代时被激活，与底物（Raf，RalGDS,3-磷脂酰肌醇激酶）发生紧密的结合。Cdc42是一种GTPase,也是信号传导相关的蛋白，它参与细胞增殖调控和肌动蛋白细胞骨架的调控。CdC42在参与细胞骨架调控的过程中，重要的一步是与WASP蛋白的相互作用。第34页，共51页，星期日，2025年，2月5日第35页，共51页，星期日，2025年，2月5日6μM50μM6μM50μM第36页，共51页，星期日，2025年，2月5日关于生物物理技术等温微量量热法第1页，共51页，星期日，2025年，2月5日内容ITC方法的基本原理ITC方法的主要优点ITC方法的主要应用第2页，共51页，星期日，2025年，2月5日一.ITC方法的基本原理生物分子相互作用过程的定量描述蛋白质P与配体L相互作用（1:1结合）：当体系达到平衡时，结合平衡常数Ka：Ka倒数为解离平衡常数Kd：DissociateconstantKd定量描述蛋白质与配体的相互作用强度（affinity）mM---弱作用，μM---中等强度作用，nM---强作用第3页，共51页，星期日，2025年，2月5日第4页，共51页，星期日，2025年，2月5日分子结合反应是吸热或放热过程复杂反应过程：整个反应过程能够自发进行的条件是△G0.

当△H0时，说明反应由焓驱动；当–T△S0时，说明反应由熵驱动；即△S0,整个反应是个熵增的过程。第5页，共51页，星期日，2025年，2月5日第6页，共51页，星期日，2025年，2月5日第7页，共51页，星期日，2025年，2月5日量热法（Calorimetry）在程序控温过程中，测量热量随时间的变化关系差示扫描量热法(DSC)等温微量量热法(ITC)第8页，共51页，星期日，2025年，2月5日DSC(DifferentialScanningCalorimetry)通过检测生物体系在控温过程中的热量变化，获取与蛋白质热变性有关的大量信息研究：生物分子的热稳定性，蛋白质构象变化、热稳定性、热变性的原因,热变性动力学,热稳定性与生理活性的关系，等等。根据测量方法的不同,分为：功率补偿差示扫描量热法热流式差示扫描量热法。第9页，共51页，星期日，2025年，2月5日第10页，共51页，星期日，2025年，2月5日ITC通过监测配体滴定到蛋白质溶液过程中的热量变化，对结合反应过程进行热力学分析，直接测量多个热力学常数，定量表征生物分子间相互作用。ITC是目前研究生物分子相互作用的最有力工具之一，常用来测量结合强度，确定结合部位个数。ITC(IsothermalTitrationCalorimetry)第11页，共51页，星期日，2025年，2月5日ITC仪结构原理示意图第12页，共51页，星期日，2025年，2月5日ITC仪包括两个相同的小池，由高效导热物质(镍合金)制成，外面包围着隔热套。灵敏的热电堆/热电偶电路可检测两小池以及小池与隔热套之间的温差。靶蛋白溶液放在样品池中，小分子由计算机控制的步进电动机通过注射器精确地滴加到样品池中