HBVcccDNA及其意义课件.ppt

HBVcccDNA及其意义*Moraleda等通过土拨鼠原代细胞抗病毒研究结果显示，cccDNA的半衰期很长，其清除依赖于感染细胞的死亡。但是也有相反的报道。尽管用人的原代肝细胞感染HBV，可以观察到cccDNA的合成和缓慢增加，但到目前为止还没有原代人肝细胞中cccDNA的半衰期的报道。感染科HBVcccDNA及其意义*三、核苷类似物不能阻止

初始cccDNA的形成Delmas等研究发现，阿德福韦能降低培养细胞内DHBVDNA(包括cccDNA)水平，说明病毒感染后起始的病毒基因组向cccDNA的转换在阿德福韦存在的情况下仍能发生，但扩增合成cccDNA的过程被抑制。感染科HBVcccDNA及其意义*Kock等研究发现，阿德福韦、拉米夫定都可以部分抑制病毒感染后初始的cccDNA转换，前者作用更强，但是，即使联合用药也不能完全抑制初始cccDNA的转换。因此，说明抗病毒药物治疗期间HBV仍有能力感染新的肝细胞，给抗病毒治疗带来困难，因而对慢乙肝患者需要长期使用抗病毒药物治疗。感染科HBVcccDNA及其意义*四、HBVcccDNA检测方法1.细胞内cccDNA的抽提与纯化最常用的抽提细胞内cccDNA的方法是蛋白质－去污剂沉淀法，其原理是基于rcDNA和cccDNA与蛋白质结合能力的差异。rcDNA能与蛋白质共价结合，与绝大多数细胞染色体DNA一起形成沉淀，而cccDNA不能与蛋白质结合故游离于上清中，用酚氯仿抽提上清即可得到cccDNA。根据缪晓辉等的经验，该方法的主要缺点是：抽提较为费时，一般需要4-5小时；酚氯仿抽提环节多、得率不高；对于冻存的富集细胞（pellet）难以充分裂解，单裂解这一步可能需要3-4小时甚至更长时间。此外，在上清中实际仍然含有少量的rcDNA，而在沉淀中实际上也存在着一部分cccDNA。感染科HBVcccDNA及其意义*为进一步分离cccDNA、rcDNA和单链DNA，可以对抽提产物进行纯化。以酶切法最为常用。外切核酸酶Ⅲ是一种3’→5’外切酶，对带有钝端、5’突出端或有缺口的双链具有特异性，而不能降解带有3’突出端（至少4个碱基）的双链DNA。绿豆核酸酶则以内切方式降解单链DNA或RNA，而保持双链DNA的完整性（二者的比活性1000），可用于选择性切除双链DNA的突出单链末端，以及切除单链DNA或RNA。也可单用绿豆核酸酶酶切rcDNA，或先用外切核酸酶Ⅲ将rcDNA降解成单链，然后再用绿豆核酸酶酶切。感染科HBVcccDNA及其意义*该方法也有其缺点：如抽提产物被稀释，降低了检测敏感度；绿豆核酸酶的反应缓冲液对PCR反应有抑制作用等。缪晓辉等尝试用小量质粒抽提试剂盒抽提去抽提HepG2.2.15细胞内的cccDNA，结果发现得率比上述所用方法均要高，操作也简便，所有操作在30分钟内就可完成。感染科HBVcccDNA及其意义*2.cccDNA的定性检测既往绝大多数文献报道的是用Southernblot对cccDNA进行定性检测，该方法是分子生物学的经典方法，但技术要求较高，敏感度低。感染科HBVcccDNA及其意义*近年来，也有较多文献报道用PCR技术对cccDNA进行检测。但是，由于PCR技术灵敏度极高，rcDNA和cccDNA的序列又具有高度的同源性，因此在用PCR技术检测cccDNA时，必须确保只能扩增cccDNA而rcDNA不被扩增。目前利用rcDNA和cccDNA结构上的差异可以解决这一问题。由于rcDNA的正链和负链上均存在缺口，故可以设计跨越两个缺口的引物，使rcDNA不会被扩增，而cccDNA由于是完整的双链结构则可以被选择性扩增。同时可设计另一对不跨越缺口的引物或只跨越一条链的缺口的引物同时检测cccDNA和rcDNA[图1]。Kock等成功地用这种选择性PCR的方法在检测感染细胞内的cccDNA和rcDNA。感染科HBVcccDNA及其意义*此外，为进一步提高检测的灵敏度，可用套式PCR(nestedPCR)的方法。

感染科HBVcccDNA及其意义*感染科·HBVcccDNA及其意义*但是有报道认为跨缺口引物对两种DNA的选择性不是绝对的，在PCR检测cccDNA时，起始模板量不能过高，否则rcDNA也有可能被扩增，Kock等发现每个PCR反应管中HBVDNA的量在1pg（约6×105拷贝）时能达到最佳的灵敏度与选择性，因此在分析前应估计标本中HBVDNA的量。虽然套式PCR更为灵敏，但由于需取PCR产物进行再次扩增，因此在操作中要注意防止PCR产物污染，