1.ELISA操作注意事项-肥达氏反应检测操作规程.pptx

一、肥达氏反应检测操作规程;第一排;如上图作倍比稀释：

方法：取一支大试管，加入4.9ml生理盐水，125ul被检血清配成1:40的样品稀释液，每次从中取出500ul加入到第一排的各试管中。再向大试管中加入2.5ml生理盐水，混匀后每次取出500ul加入到第二排的各试管中，重复上述操作直到第七排试管。再向各试管中加入25ul混匀菌液。

;同时作阴性对照，每项做一个。方法：25ul混匀菌液加到500ul生理盐水。

混匀试管后放入37℃水浴箱中过夜。第二日观察结果，阳性对照良好的前提下，出现明显凝集现象的最大稀释倍数为结果。

;临床应用：

机体感染伤寒杆菌一周，可出现抗菌体“O”抗原抗体和抗鞭毛“H”抗原抗体。

可作为伤寒和副伤寒感染的辅助诊断。

参考值:O凝集价:80;H凝集价:160才有诊断意义。

如急性期，恢复期双份血清效价4倍以上增长更有意义。但近期接种过伤寒、副伤寒疫苗者，其凝集价亦可升高。

;注意事项：

1．标本要新鲜。

2．严格按照说明书操作。

相关文件或参考文献：

1．全国临床检验操作规程；

2．临床免疫学检验技术

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;二、乙型肝炎表面抗原

（HBsAg）检测规程

ELISA操作及注意事项

;标本种类及采集：

采集前病人准备：受检者应空腹

标本种类：血清或血浆

标本要求：采集病人静脉血，室温放置不超过4小时，分离血清备用。

标本储存：2-8℃保存不应超过1周，-20℃不应超过3个月，-70℃长期保存，应避免反复冻融。

;实验原理

;使用仪器：加样器酶标仪

;试剂盒组成：;试剂储存条件及有效期：

2-8℃避光保存，有效期9个月。

;操作步骤：

1.平衡：将试剂盒各组分取出，平衡至室温（18-25℃），微孔板开封后，余者及时以自封袋封存。

2.配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。

3.编号：将微孔条固定于支架，按序编号。

4.加样：待检样品和质控品50微升加入反应孔内，同时加阴性对照2孔，阳性对照1孔每孔50微升，设空白孔1孔。

5.加酶：各孔分别加入酶结合物1滴（空白孔除外），充分混匀后置37℃水浴箱孵育30分钟。

;操作步骤：

6.洗板：取出反应板，用洗板机洗板5次，用吸水纸拍干。

7.显色：各孔加底物液A液，B液各1滴，混匀，置37℃水浴箱孵育15分钟。

8.比色：每孔加入终止液1滴，混匀。用酶标仪读数：取波长450nm，参考波长630nm，先用空孔校零，然后读取各孔OD值。

9.结果判断与分析

样品OD值/阴性对照平均OD值≥2.1判断为阳性，否则为阴性。

注：阴性对照小于0.05按0.05计算，大于等于0.05按实际OD值计算。;乙型肝炎病毒（HBV）属于DNA病毒。HBsAg存在于HBV外壳部分的糖蛋白，是诊断乙型病毒性肝炎诊断标准之一。

目前检测下限为0.2ng/ml

临床意义如下：

;1、是乙型肝炎病毒感染的早期指标，大多数病例出现于感染后1～2个月，ALT升高前2～8周出现于血清中，8～9周其滴度达高峰。定量检测其含量在5ng～0.2μg/ml之间，少数可达2000μg/ml以上。以后随病情好转，逐渐降低或消失，有部分病例可维持数年、数十年甚至终身，如无症状者为HBsAg携带者。

;2、慢性迁延性肝炎、慢性活动性肝炎、肝硬化、肝癌；慢性HBsAg携带者也常出现阳性病例。;3、HBsAg阳性仅为感染的标志，不反映病毒有无复制、复制程度、传染性强弱及预后。

4、HBsAg也可从唾液、乳液、精液等分泌物中检出。

;安全性预警措施：

1如果出现血液污染容器或检验申请单，则应坚决拒收，防止污染的扩散和传播，应该立即对污染的环境和设备进行消毒处理

2对表明有传染性疾病的血液标本应特别防护，以不污染环境或保护工作安全为前提。

3标本应加盖离心，离心后，应该在生物安全柜中开盖，以防止气溶胶污染环境。

4实验室工作人员应该佩带手套，防止污染。

5与血液标本接触的一切器皿，仪器等都应视为污染源，因此操作人员不小心接触了这种污染源时，应立即用清水冲洗，擦拭被污染区域并进行消毒处理。

;变异潜在来源：

1标本采集时应尽量避免溶血，因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰结果，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本会增加非特异性显色造成假阳性。

2长菌的标本同样的道理也易产生假阳性，因菌体中可能含有内源性HRP也会产生假阳性反应。

3标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合，使间接法的试剂本底加深，一般血清置4℃冰箱5天内完成测试。

4ELISA的灵敏度＞1ng/ml水平上，标本间的污染要尽量避免，尤其不应与生化实验用同一管标本。

;报告时间与标本保存和处理：

当日