植物叶片中DNA的提取.ppt

植物叶片DNA的提取

DNAextraction实验一实验原理利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中,可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库,初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析,DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同;不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子，尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。实验材料和试剂实验材料：植物幼嫩叶子。实验所需试剂：提取缓冲液Ⅰ：100mmol/LTris·Cl(pH8.0),20mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl,1.5%SDS2.80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇3.RnaseA母液其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/LNaAc。实验仪器离心机各种型号的微量移液枪研钵不同型号的eppendorf管实验步骤：水稻幼苗或叶片0.1-0.2g,剪碎,置研钵中，加入1mL提取缓冲液，研磨成浆；2.吸入1.5mLEP管中，剧烈摇动混匀；3.60℃水浴保温30-60min，不时颠倒混匀；4.室温下10000rpm离心5min；5.小心吸上清于新的离心管中，加入等体积氯仿，剧烈震动；6.室温下10000rpm离心5min；7.小心将上清吸入新的离心管中；8.加入1倍体积异丙醇，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。8000rpm离心5min，弃掉上清；75％酒精洗一次，晾干沉淀；10.加入5μLRNaseA（10μg/μL）,37℃10min,除去RNA。11.加50-100μl水融解，-20贮存。1.植物叶子0.1-0.2g,剪碎置预冷研钵中加入1mL提取缓冲液，研磨成浆2.吸入1.5mLeppendorf管中，摇动混匀3.60℃水浴保温30-60min4.10000rpm离心5min吸上清于新的离心管中，加入等体积氯仿，颠倒混匀再次10000rpm离心5min；将上清小心吸入新的离心管中；加50-100μL的TEBuffer，取1-5μL电泳检测；其余-20℃贮存备用。随后8000rpm离心5min，弃掉上清；75％酒精洗沉淀一次晾干沉淀；加5μLRNaseA(10μg/μL),37℃10min,除去RNA；加入1倍体积异丙醇，-20℃放置10min，出现絮状DNA沉淀；