植物花药培养及单倍体植株鉴定.pptVIP

**植物花药培养及单倍体植株鉴定20学时安徽农业大学生命科学学院高俊山花药培养：是指将未成熟的花药接种在人工培养基上分化成为植株的过程。

属于器官培养。

供体植株小孢子（n）花培花粉植株（n）雄核发育自然加倍人工加倍纯合植株DH（2n）一年内获得纯系常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。0201掌握植物花药离体培养技术；掌握单倍体植株鉴定的方法；了解单倍体育种的意义。目的：利用组织培养技术对植物花药进行离体培养，诱导产生再生植株。通过形态观察和染色体分析鉴定单倍体植株，作为新的遗传资源和选择材料。原理：一、实验目的与原理花药培养基本流程：预处理花药（物理或生理逆境）收集具有胚性小孢子的花药培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株选择合适的供体植株单倍体植株鉴定镜检花粉发育时期01花药离体培养02取样03消毒04接种05培养06单倍体植株的鉴定07二、实验内容材料：烟草花药。试剂：MS培养基、N6培养基、B5培养基、酒精、2,4-D、NAA、KT、蔗糖、醋酸洋红、蒸馏水。仪器：电子天平、磁力加热搅拌器、普通光学显微镜、微波炉、pH计、培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、镊子、剪刀、解剖针、烧杯、试剂瓶、三角瓶、封口膜、橡皮筋、低温冰箱。三、实验器材四、实验步骤1.适期花药的选择花药中的花粉是由生殖细胞（体细胞）经过减数分裂而来，其染色体只是体细胞中的一半，如果通过一定的途径将花粉培养成植株，获得单倍体植株。再经过染色体加倍，得到纯合的二倍体，大大缩短育种进程。一般而言，单核期（第一次有丝分裂前）对诱导反应最敏感，为最佳培养期。形成双核后，在合适的条件下，主要由营养细胞分裂产生胚状体。?花粉发育时期：被子植物的花粉发育可分为四分体期、单核期（小孢子期）、二核期和三核期（雄配子期）4个时期。花粉的发育四分体时期单核靠边期花药切片显微观察营养细胞生殖细胞精子四分体:醋酸洋红染色四分体:Alexander’s染色单核期双核期成熟花粉粒烟草花粉发育时期的检测：一般将植物的花药置于载玻片上压碎，加1-2滴1%醋酸洋红染色，再进行镜检，以确定花粉发育时期。单核晚期?液泡第一次有丝分裂后期双核早期双核中期?生殖核?生殖核营养核?烟草花粉发育时期的确定处于不同发育阶段的烟草花芽烟草花粉培养，选择单核靠边期的花药，培养效果最好。从烟草花的外部形态变化来看，当花蕾的花冠长度与花萼的长度相等时，花药里面的多数花粉粒正处于单核靠边的阶段。不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期发育时期物种减数分裂期草莓、番茄四分孢子期葡萄单核早中期石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯单核晚期荔枝、茄子、青椒、小麦单核早期至晚期烟草单核早期至双核期梨、水稻、甘蓝四分孢子期至双核期玉米取材镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。（考虑供体植物基因型、生理状态）接种剥去萼片和花瓣，将花药取出。去除花丝，但不应使花药受到损伤。消毒70％酒精擦洗花蕾表面，70％酒精浸泡15-30s后，在1％次氯酸钠溶液中浸泡8-10min或在0.1％的氯化汞溶液中消毒8-10min，无菌水冲洗3-5次。培养先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。23412.花药离体培养花药培养过程取花蕾（镜检）预处理取花药消毒接种培养愈伤组织发生预处理预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加。预处理是小孢子培养成功的前提条件。预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。烟草花药培养，4℃低温预处理2-3天。1234主要为MS、H、N6、B5和Nitsch培养基，在此基础上发展出一些其它的培养基。H培养基（基本成分+6-BA/KT2mg/L+NAA/2,4-D0.2mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+1g/L活性炭，pH值）上诱导愈伤组织；愈伤组织形成后转移到H培养基（基本成分+NAA2mg/L+6-BA0.2mg/L+20g/L蔗糖+7g/L琼脂）上分化成苗。1/2MS培养基+激素+蔗糖+琼脂+活性炭②培养基01高浓度的NH4+显著抑制花粉愈伤组织