《病原生物与免疫学》第12章 免疫组织化学技术.pptx

医学技术学院免疫教研室;

掌握：酶免疫组织化学技术；

了解：免疫组化技术要点、荧光免疫组织化学技术、亲和组织化学技术；

;一酶免疫组织化学技术

二荧光免疫组织化学技术

三亲和组织化学技术

四免疫标记电镜技术

五免疫组织化学技术应用

六影响免疫组织化学技术的主要因素

;第一节

酶免疫组织化学技术;组织切片

常用的标本组织印片

细胞涂片;定义:借助交联剂的共价键将酶直接连接在抗体上，酶标抗体与靶抗原反应后，再通过对底物的特异性催化作用，生成不溶性有色产物，达到对抗原定性、定量、定位检测的目的。

方法：直接法和间接法

;特点:

用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体

酶通过免疫学反应与抗酶抗体及组织抗原上的第一抗体结合，最后经酶分子催化底物的显色反应，达到对抗原的检测;酶桥法：抗酶抗体作为第三抗体，通过第二抗体作桥抗体，将结合在组织抗原上的第一抗体与第三抗体连接起来，最后形成酶联的抗原-抗体复合物，底物显色。;PAP法：是酶桥法的改良法。PAP法将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶形成一种稳定可溶性(PAP复合物);双桥PAP法：是在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上。;APAAP法：用碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶(AP)-抗碱性磷酶(AAP)法，简称APAAP法;1、辣根过氧化物酶/HRP

底物（二氨基联苯胺）显色棕色最常用

2、碱性磷酸酶/AP

底物（萘酚，快蓝）显深蓝色最敏感

3、葡萄糖氧化酶/GOD

底物（葡萄糖）显蓝色;第二节

荧光免疫组织化学技术;常用的荧光素：

FITC黄绿色；PE红色

;直接法：

优点：

操作简便、特异性高

缺点：

敏感度偏低

抗体制备烦锁

;间接法：

优点：较直接法灵敏，标记一种抗

体可以鉴定多种抗原

缺点：非特异荧光、操作时间较长

;第三节亲合组织化学技术;待测抗原

非特异性抗原;ABC间接法原理示意图;桥联亲合素-生物素技术;BRAB直接法原理示意图;第四节免疫标记电镜技术;第五节

免疫组化技术的临床应用;一、荧光免疫组化技术的临床应用

1、自身免疫病

2、细菌和病毒的快速鉴定

3、寄生虫的检测与研究

;;;;;二、酶免疫组化技术的临床应用

1、提高病理诊断准确性

2、癌基因蛋白-定位、定量

3、对肿瘤细胞增生程度的评价

4、发现微小转移灶

5、在肿瘤分期上的意义

6、指导肿瘤的治疗;1、提高病理诊断准确性（HE可观察到炎性细胞浸润，ED1染色可观察到巨噬细胞浸润）;;;;;荧光激活细胞分类仪（FACS）;第六节

影响免疫组织化学技术主要因素;（一）标本的主要来源

1活体组织：实验动物和人体活检组织。

2各种体液及穿刺液

3培养细胞;1.固定的目的：不损伤组织细胞的固有

形态、结构、抗原性和细胞膜的通透

性；不干扰固定后的抗原与抗体的识

别与结合

2.固定剂的选择：所有的标本固定必须

根据其性质及所进行的组织化学反应

选择适当的固定剂;蛋白质类抗原：乙醇或甲醇

微生物抗原：丙酮或三氯化碳

多糖抗原：10%福尔马林固定

类脂丰富：有机溶剂（乙醚）;冰冻切片：：

较好地保存组织抗原的免疫活性

石蜡切片：

形态保存好，可以用于回顾性研究

;抗原修复:使遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的方法。

常用的方法有：

酶消化法

盐酸水解法

微波法

高压锅法

煮沸法

;（一）抗体的选择

;抗原抗体反应要比例合适才能达到预期效果

使用前根据预实验结果得出抗体的最佳稀释度

;分装密封保存，避免对抗体的污染并注明标记（批号、名称、效价）

避免反复冻融而使抗体效价降低。;必

须

设

立

对

照;阳性细胞显色分布类型

细胞质

细胞核

细胞膜表面;阳性显色深浅反映抗原存在的数量

可以作为

定性的依据

定位的依据

定量的依据;阳性细胞分布分为

散在分布

灶性分布

弥散分布;特异性染色;不一致：

结合临床资料，如性别、年龄、部位等影像学及实验室结果综合分析

;抗体特异性、敏感性测试

抗体最佳稀释度的选择

稀释剂

抗体孵育温度、时间;操作：

步骤是否正确规