植物分子生物学-第一章植物基因的同源克隆.pptVIP

PCR反应体系的组成10×PCRBuffer（Mg2+plus):100mMTris-HCl，pH8.3；500mMKCl；0.1%geltin；15mMMgCl2。MgCl2:母液15mM或25mM，工作浓度。dNTP:母液10mM或2mM，工作浓度200μM。引物：母液10μM或20μM，工作浓度μM。TaqDNApolymerse:1-3U。模板DNA：1-500ng。PCR反应体系PART820μl反应体系10×PCRBuffer（Mg2+-free）:2μlMgCl2(15mM):2μldNTP(10mM):0.3μl5/-Primer(10μM):0.25μl3/-Primer(10μM):0.25μlDNA模板：10-250ngTaqDNApolymerase:1-2UddH2O:加至20μl50μl反应体系10×PCRBuffer（Mg2+-free）:5μlMgCl2(15mM):3μldNTP(10mM):0.6μl5/-Primer(10μM):0.5μl3/-Primer(10μM):0.5μlDNA模板：10-250ngTaqDNApolymerase:1-2UddH2O:加至50μl100μl反应体系10×PCRBuffer:10μlMgCl2(15mM):10μl（）dNTP(10mM):10μl(各为200μΜ)5/-Primer(10μM):1μl（0.1-0.5μΜ）3/-Primer(10μM):1μl（0.1-0.5μΜ）TaqDNApolymerase(5.0U/μl）：3-5U基因组DNA模板：10-250ngddH2O:加至100μl94℃2-5min94℃30-40s退火温度1min25-40cycles72℃1-2min72℃7-10min4℃保存321456PCR反应条件循环数：25-30个循环。04延伸：一般为70-75℃（常用72℃），扩增长度为1-2kb时延伸时间为1min，大于2kb时可适当延长至5-10min，引物长度小于16bp，可采用使延伸温度缓慢上升到70-75℃，在最后一轮循环后在70-75℃(72℃)延伸10min。05初变性：94℃5min。01退火：退火温度（55-72℃）一般选择比理论Tm低5-10℃（常用5℃左右）。03预变性：94℃30-45s。02PCR反应条件的选择94℃初变性5min，94℃30s、55℃30s、0172℃1min，25-30个循环，72℃10min后4℃停止反应。02常用的PCR反应条件1Mg2+浓度的优化：范围：0.5mM-10mM。采用二步法优化：第一步—0.5~5.0mM，梯度为0.5mM；第二步—梯度为0.2或0.3mM。2热启动PCR：在第一个循环的温度升高到Tm值后加入Taq酶；使用热激活的AmpliTaqGold酶；使用含TaqStartAntibody的Taq酶。3TD-PCR（TouchdownPCR)4SD-PCR(StepdownPCR)PCR条件的优化TD-PCR:适用于引物是根据氨基酸序列设计或同源扩增多基因家族成员；退火温度的范围：大于Tm值几度到低于Tm值十几度，跨越15℃左右。温度降幅为0.5-1℃，每个温度进行2个循环，最后在低于Tm值10℃（50℃）进行10-15个循环。SD-PCR：设置7个2℃一变的步骤或5个3℃一变的步骤，每个水平的循环数为4。12木奈PPO基因保守区片段的PCR产物（ReverseTranscriptionPCR)RT-PCR逆转录反应PART9在冷冻条件下研磨植物材料，以抑制RNase的活性。在提取缓冲液中加入蛋白质变性剂（苯酚、胍、SDS、CTAB等）。利用蛋白酶K降解蛋白质。利用苯酚、氯仿抽提。用70%高氯酸钠溶液沉淀蛋白质。植物DNA和RNA的检测PART21.凝胶电泳：琼脂糖浓度为0.7-1.0%，胶用1×TAE或1×或0.5×TBE电泳缓冲液配制，加入0.5μg/ml溴化乙锭（EB），平板胶厚度为3-5mm。上样缓冲液：