细胞融合课件.pptVIP

在HAT選擇培養液中含有次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷，當DNA主要合成途徑被氨基喋呤阻斷時，具有HGPRT酶和TK酶的細胞便可通過應急途徑利用HAT培養液中的次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷合成DNA。未融合脾細胞未融合骨髓瘤細胞自身融合的脾細胞自身融合的骨髓瘤細胞雜交瘤細胞(脾細胞/骨髓瘤細胞)存活存活存活死亡死亡脾細胞——HGPRT+和TK+用來製備雜交瘤細胞的骨髓瘤細胞——HGPRT-和TK-短命融合後細胞混合液HAT培養基培養2周正常培養基HT培養基培養1周HAT培養基的篩選程式：雜交瘤細胞融合後的細胞混合液在HAT培養基中培養兩周後，只有雜交瘤細胞能存活下來所篩選出的雜交瘤細胞並非均分泌針對於目的抗原的抗體，還需要把含有分泌抗體雜交瘤細胞的培養孔挑選出來，因此需要進行抗體檢測。3、抗體檢測簡便、快速、敏感;在短時間內能檢測大量樣品常用方法：酶聯免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)間接免疫螢光法(Indirectimmunofluorescence,IFA)放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)雙相擴散法要求抗原酶聯免疫吸附法(ELISA)第1抗體酶第2抗體待檢雜交瘤培養上清液底物有色產物酶標儀檢測技術原理：4、克隆化在體外培養時分泌抗體的雜交瘤細胞的分裂速度要慢於不分泌抗體的雜交瘤細胞，經過多次傳代培養後很容易丟失，故需要及時地把分泌抗體的雜交瘤細胞挑選出來單獨培養。*穀氨醯胺(Gln)，由次黃嘌呤和5一磷酸核糖焦磷酸在次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶的作用下，合成次黃嘌呤核苷酸(IMP，又叫肌苷酸)。*Recipientegg：受體卵；surrogateuterus：代理子宮?細胞融合細胞融合是指2個或2個以上的細胞融合成1個細胞的過程。人工的細胞融合開始於1950s，此後作為一門新興技術發展非常快，應用範圍也極為廣泛，不僅同種類細胞間可以融合，種間遠緣細胞也能融合。細胞工程的發展是建立在細胞融合基礎上的。在2003年8月出版的《CellResearch》上，一篇論文介紹了上海第二醫科大學盛慧珍教授領導的研究小組的研究成果：“那不成人兔雜交了嗎？它是人？是兔？還是半人半兔？”——倫理上的普遍質疑他們將一位5歲男孩、兩位成年男性的包皮細胞、一位60歲女性面部細胞的細胞核，放入去掉細胞核的新西蘭兔卵母細胞中，成功讓融合後的細胞發育到胚泡階段，從而得到胚胎幹細胞。細胞融合不僅可用於生物學的基礎理論研究，而且在生產實踐上還有重要的應用價值，如目前在單克隆抗體的製備、核質關係、體細胞的遺傳和發育、新品種的培養、免疫作用、疾病的治療和性狀的改良、潛伏病毒的研究等，已取得了顯著的成績。其中最突出的就是在製作單克隆抗體方面的應用！第一節?細胞融合的技術方法細胞融合(Cellfusion)又稱為細胞雜交(Cellhybridization)，現多統稱為細胞雜交。同核體(homokaryon)：基因型相同的細胞融合成的雜交細胞異核體(heterokaryon)：來自不同基因型的雜交細胞根據所用促融劑的不同，細胞融合技術主要可分為四大類：病毒介導的細胞融合技術化學介導的細胞融合技術電擊介導的細胞融合技術鐳射介導的細胞融合技術一、病毒介導的細胞融合技術促融劑：麻疹病毒、副流感病毒、新城雞瘟病毒、仙臺病毒以及其他一些副粘液科的病毒大體原理：病毒被膜中的糖蛋白含有融合蛋白(fusionprotein),既可介導病毒同宿主細胞融合,又可誘導細胞與細胞融合。操作繁瑣；促融效果較好融合蛋白是副粘病毒的兩種包膜糖蛋白之一，其主要功能是引起病毒包膜與靶細胞膜或被感染的靶細胞膜之間發生融合。細胞融合過程需要另一種包膜糖蛋白――血凝素-神經氨酸酶的協助。融合蛋白需要和同源性血凝素-神經氨酸酶共同表達才能顯示出融合細胞的活性。病毒增殖紫外線滅活稀釋細胞懸液細胞融合誘導大體操作流程篩選二、化學介導的細胞融合技術聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)促融劑：大體原理：一般認為，PEG改變各類細胞的膜結構，使兩細胞相互接觸部位的膜脂雙層中磷脂分子發生疏散、進而使其結構發生重排，再加上膜脂雙層的相互親合以及彼此間表面張力的作用，引起相臨的重排質膜在修復時相互合併在一起,使兩細胞的胞質溝通,從而造成相互接觸的細胞之間發生融合。操作簡便；促融效果好誘導大體操作流程A細胞融合細胞B細胞A/B細胞混合物按一定數量比例混合與細胞混合物充分混勻一定溫度、一定時間計數篩選