低温乳制品中金黄色葡萄球菌检验 实时荧光PCR方法.docxVIP

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低温乳制品中金黄色葡萄球菌检验实时荧光PCR方法

1范围

本文件规定了巴氏杀菌乳、高温杀菌乳（低温保存）、发酵乳、调制乳等低温乳制品中金黄色葡萄球菌的实时荧光PCR检测法（商品化试剂盒方法）。

本文件适用于巴氏杀菌乳、高温杀菌乳（低温保存）、发酵乳、调制乳等低温乳制品中金黄色葡萄球菌的快速初筛及鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB4789.1食品安全国家标准食品微生物检验总则

GB4789.10食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验GB4789.28食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检验

3缩略语

下列缩略语适用于本标准。

3.1PCR

PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应。

3.2实时荧光PCR

RealTimePolymeraseChainReaction，实时荧光聚合酶链式反应。

3.3Ct值

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T/SSFSXXXX-20XXCyclethreshold，每个实时荧光PCR反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。

4仪器和设备

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备如下:

4.1恒温培养箱:36℃±1℃

4.2电子天平:感量0.1g

4.3均质器（旋刀或拍击式）或等效设备

4.4pH计或精密pH试纸:精密度0.1

4.5微量移液器及无菌带滤芯吸头

4.6金属浴:98℃±1℃

4.7掌式离心机

4.8实时荧光定量PCR仪

4.9低温冰箱

注：确证实验需要的其他仪器设备参照GB4789.10。

5试剂和耗材

5.17.5%氯化钠肉汤（见附录A)

5.2MicroFast?金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒

5.2.1裂解液管

5.2.2对照管

5.2.3复溶液管

5.2.4试剂管（含内对照）

注：确证实验需要的其他试剂和耗材参照GB4789.10。

6操作流程

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金黄色葡萄球菌检验程序见图1。

图1金黄色葡萄球菌检验程序

7操作步骤

7.1样品制备及增菌培养

将样品平衡至室温，无菌操作称取25g（mL）样品，置于盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌均质袋或其他无菌容器中，若样品是固态或半固态，用拍击式均质器拍打1min~2min混匀（或用旋转式均质器8000rpm~10000rpm均质1min~2min）；若样品是液态，不需要均质，震荡混匀即可。如使用均质袋，可直接进行培养；如使用均质杯或其他容器，无菌操作将样品转移到其他培养容器。

7.2增菌

将上述样品匀液内于36℃±1℃培养24h±2h，金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。留存增菌液，可保存在2℃~8℃,直至确证实验完成。

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7.3PCR检测

7.3.1模板制备

将7.2中培养后的增菌液混匀后，用移液器移取40μL至MicroFast?金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒的裂解液管中（裂解液可在开盖前采用合适方式将管中液体集中至底部），盖好管盖，使用金属浴加热器98℃±1℃加热10min，冷却至室温，取上清液以待检测。如无法立即检测，上清液可置于2℃

~8℃保藏不超过24h。

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7.3.2PCR反应体系配置

金黄色葡萄球菌PCR反应体系预制在0.2mLPCR反应管中，使用前平衡至室温，加入20μL复溶液，用掌式离心机离心5s~10s，加入5μL模板，盖好管盖，使用掌式离心机离心5s~10s，即可上机检测。

7.3.3PCR扩增

推荐反应程序设定如下：反应体系为25μL，在第二步每个循环60℃时检测荧光信号，检测通道选择FAM、HEX。

第一步

第二步

1个循环

45个循环

95℃

95℃60℃72℃

5min

15s30s30s

7.3.4对照设置

每次实验都应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照：不含有DNA酶的灭菌去离子水。

阴性对照：不含金黄色葡萄球菌的样品按照检验程序进行处理后获得的核酸（试剂盒内提供）