动物细胞融合与单克隆抗体课件.pptxVIP

動物細胞融合與單克隆抗體;細胞融合（cellfusion)，指用自然或人工方法、使兩個或多個來源相同或不同的細胞合併成一個細胞的過程，又稱為細胞雜交。;細胞融合示意圖;;生物種類;;;Muller於1838年觀察到脊椎動物的腫瘤細胞能在體內自發地融合產生多核的腫瘤細胞。

Virchow於1858年描述了正常組織、發炎組織以及腫瘤組織中的多核細胞現象。

Luginbuhl於1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細胞存在。

Lange於1875年第一個觀察到脊椎動物（蛙類）的血液細胞發生融合的過程。

Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動中發現了細胞合併現象。

1958年日本學者岡田（Okada）發現仙臺病毒具有觸發動物細胞融合的效應。

1965年，英國科學家進一步證實了滅活的病毒在適當的條件下也可以誘發動物細胞融合

1974年華裔加拿大學者高國楠創立了聚乙二醇（PEG）化學融合法。

1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細胞和骨髓瘤細胞而產生能分泌預定單克隆抗體的雜交瘤細胞。

20世紀80年代齊默曼（Zimmerman）等建立了電融合技術。;三.細胞融合的原理;融合過程中兩個細胞膜從彼此接觸到破裂形成細胞橋的變化過程圖解;顯微鏡下細胞融合過程;第二節細胞融合方法;人工誘導的融合方法有哪些？;研究最早的細胞融合誘導方法。

多用仙臺病毒(HVJ，HemagglutinatingvirusofJap-an)，是由兩層磷脂組成的外膜包裹著RNA和蛋白質的複合體，毒力弱，易滅活，常採用。

原因：HVJ含有細胞表面受體的結合位點，可以促使不同細胞凝聚，再通過膜上蛋白質分子和脂類分子的重新排布，最終使細胞質膜相互融合。可能是病毒外殼上的某些糖蛋白有促進細胞融合的功能。

實驗證明：仙臺病毒HVJ的外膜是誘導細胞融合的活力部位，與其外膜上的磷脂成分有關，即使被超聲波打碎的病毒碎片仍具有促進細胞融合的功能，而與其內部RNA活性無關，即可用滅活的HVJ發揮促融作用。;;病毒促使細胞融合過程：

;仙臺病毒誘導細胞融合主要步驟：

①兩種細胞懸液混合離心，取沉澱，加入滅活的病毒懸液，冰浴20min,細胞相互凝聚；

②在37℃中，間歇搖動30min，病毒與細胞膜發生反應，細??膜受到破環；

②細胞膜連接部穿通，周邊連接部修復；

④融合成一個細胞，選擇性培養基篩選。;融合要點

細胞的融合與HVJ數量有密切關係，每一細胞必須有足夠數量的病毒顆粒附著在細胞膜上，細胞才能凝聚。

細胞最適的凝聚溫度是4℃，細胞融合的最適溫度一般是37℃。因此，在HVJ促融過程中，要先在4℃下細胞凝聚，然後恢復在37℃融合。

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聚乙二醇(PEG)結構為：H（CH2CH2O)nOH（n=4～450)

融合效率與PEG相對分子品質和濃度有關，分子量1000～4000、濃度為30％～50％的PEG具有較好的促融合效果。

PEG溶液在pH8.0-8.2時細胞融合率最高。

;PEG的作用機理：與PEG強烈的吸水性以及凝聚和沉澱蛋白質的作用有關。具體機理，目前還不太清楚。

Kao等認為，由於PEG分子具有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質和碳水化合物等形成H鍵，從而在在質膜之間形成分子橋，其結果是使細胞質膜發生粘連進而促使質膜的融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使細胞的核、細胞器發生融合成為可能。

;優點：融合成本低，使用方便，勿需特殊設備；融合效果穩定；融合效率高(比仙臺病毒高100-300倍）；融合過程不受物種限制。

缺點：PEG可能對細胞有毒害，細胞融合或致死劑量界限很狹，需嚴格掌握時間。

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;細胞融合劑;聚乙二醇（PEG）法細胞融合過程;聚乙二醇（PEG）法細胞融合步驟

（1）將兩種不同親本細胞各5×l06混勻；

（2）離心沉澱，吸去上清液；

（3）加1ml50％PEG溶液，用吸管吹打，使之與細胞接觸1分鐘；

（4）加9ml培養液，離心沉澱，吸去上清液；

（5）加5ml培養液，分別接種5個直徑60mm平皿，每個平皿加培養液至5ml，37℃的CO2培養箱中培養。

（6）6—24小時後，換成選擇培養液篩選雜交細胞。;3、物理法--電誘導融合;電融合的基本過程：

細胞膜的接觸：當細胞置於電導率很低的溶液中時，電場通電後，電流即通過細胞而不是通過溶液，細胞膜表面的電荷和氧化還原電位發生改變，從而使細胞粘合；

膜的擊穿：細胞成串排列後，立即給予高頻直流脈衝就可以使質膜擊穿，從而導致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。;;;影響動物細胞融合的因素

1.細胞種類和性質的影響：

（1）細胞的表面