感受态细胞和质粒DNA的转化(C).ppt

lon(longform)分解异型蛋白质的ATP依赖型蛋白分解酶活性缺失。大肠杆菌B株原来就为lon-。可抑制其表达的融合蛋白质的分解。01omp(outermembraneprotein)外膜蛋白膜结合性蛋白分解酶活性缺失。抑制表达的融合蛋白质的分解。02宿主蛋白酶缺失感受态细胞和质粒DNA的转化导入大肠杆菌: 氯化钙转化法electroporation电击法又叫电穿孔法体外包装感染法重组DNA导入哺乳动物细胞:DNA-磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖转染法脂质体介导法、原生质体融合法酵母菌转化法:完整细胞转化法原生质体转化法电击法大肠杆菌(Escherichiacoli)大肠杆菌(Escherichiacoli)大约含3000kb的环状染色体DNA的棒状细菌。革兰氏阴性、兼性厌氧。最适生长温度37℃，PH7.0～7.6(一般7.4)，保存加甘油，培养皿密封。大肠杆菌的生长曲线可分为迟缓期(生长滞后期)、对数生长期(20~30min)、稳定期(饱和期)，约1×109~2×108/mL和衰老期。大肠杆菌的不同菌株的保存期差别较大。有些菌株在液体培养基中，4℃可保存几个月，而有些菌株在相同条件下只能保存几天。如在相同条件下，大肠杆菌K12株比大肠杆菌X1776株保存期长。所以菌株首先应划平板分离单个菌落，经扩增后再做抗药性等鉴定，然后应用或保存。保存一般用对数生长后期的细菌。根据不同需要做短期、中期或长期保存。2.菌株的保存具体保存方法：①LB琼脂平板划线，37℃，倒置平板培养(16-24hr)，形成单一菌落后，用石腊纸(parafilm)将平皿四周封严(使平皿隔绝空气)，倒置放入4℃或-20℃冰箱中，可保存数周。E.coli菌株的生存期差别大：有些菌株在液体培养基中，4℃能存活几个月。有些菌株只能活几天。②穿刺琼脂(stabagar)，室温，避光可保存数年。③冰冻：单一菌落，液体培养基中扩增后，稀释后倒入10-50%甘油培养基中，分装，置-20～-70℃。可经过30次冻融，细菌仍然存活。菌LB中过液培养，加入等体积2×冰冻培养基。液氮速冻后置-70℃，可经15次冻融，保存5年以上。菌株保存液的配制琼脂穿刺培养基2×冰冻培养基琼脂（Difco）6gK2HPO412.6g细菌胰蛋白胨（Difco）10gN++-柠檬酸0.19gNaCl8gMgSO4＞H2O0.18gHCl20mg(NH4)2SO41.8gddH2O至1LKH2PO43.6g甘油88gdH2O至1L高压灭菌 Phagemid -20℃ Enzyme -20℃ Buffers -20℃ Primer -4℃ Thiodeyivatives -20℃ Ribonucleotides -20℃ Helperphage -4℃ 置于—20℃或—80℃，并一个月检查一次 抗生素的配制抗生素工作浓度松驰型质粒严紧型质粒氨苄青霉素(Amp)50mg/mL（水）60ug/mL20ug/mL氯霉素(Cm)34mg/mL（乙醇）170ug/mL25ug/mL卡那霉素(Kan)50ug/mL（水）50ug/mL10ug/mL链霉素(Sm)10mg/mL（水）50ug/mL10ug/mL四环素(Tc)5mg/mL（乙醇）50ug/mL10ug/mL大肠杆菌感受态细胞制备和贮存在基因工程研究过程中，常常需要将外源DNA与载体DNA连接，重组后，导入大肠杆菌受体细胞中，进行DNA复制，扩增或表达，噬菌体单链或双链DNA导入大肠杆菌宿主菌中复制扩增。但很久以前人们就试图将DNA转化大肠杆菌但都没有成功。因此长期以来人们一直认为大肠杆菌缺乏天然的转化机理。1970年M.Mandela和A.Higa提出，在转化DNA之前，预先用氯化钙溶液处理大肠杆菌，能够人为地诱导这些大肠杆菌细胞呈现感受态，这种细胞称为感受态细胞。从而提高重组DNA转化入大肠杆菌的转化频率。目前对这种机制尚不清楚。感受态细胞(Compenentcells)：将质粒DNA或重组质粒DNA转化到宿主菌中之前，必须使细菌呈感受状，即有能力摄取DNA的状态。(主要介绍用氯化钙溶液处理大肠杆菌制备感受态细胞的方法)①取出大肠杆菌HB101菌种管划LB琼脂平板，-70℃保存，37℃过夜(一般16小时)。②取一个菌落接种于3~5mlLB培养管中，37℃振培养，过夜(8~16小时)