3.1基因工程及其技术（2）-PCR技术、基因工程的基本操作程序课件高二下学期生物苏教版选择性必修3.pptx

第三章基因工程第1.2节PCR技术、基因工程的基本操作程序

目的基因的获取基因表达载体的构建（核心）将目的基因导入受体细胞目的基因及其表达产物的检测与鉴定基因工程的基本操作程序

从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指编码蛋白质的基因。一、目的基因的获取（1）目的基因：（2）筛选合适的目的基因：例如：培育转基因抗虫棉目的培育抗虫棉已有研究成果①苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害；②苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关；③对Bt基因的序列信息和其表达产物Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解合适的目的基因Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因

一、目的基因的获取（3）目的基因获取的方法：从生物组织中直接获取化学方法直接人工合成从基因文库中获取目的基因利用PCR技术扩增目的基因

从生物组织中直接获取*①从供体细胞直接获取目的基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。这种方法犹如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。②鸟枪法的具体做法：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别构建表达载体，然后通过载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫作扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的细胞分离出来，如许多抗虫、抗病毒的基因都可以用该方法获得。③用“鸟枪法”获取目的基因的缺点是工作量大，具有一定的盲目性。

化学方法直接人工合成①反转录法*：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成双链DNA，其过程如下：目的基因的mRNA双链DNA（目的基因）反转录②化学合成法：a.对比较小的目的基因，明确脱氧核苷酸序列后，可通过DNA合成仪直接人工合成；一种DNA合成仪

化学方法直接人工合成②化学合成法：b.对于全基因或较大基因，采用半合成的方法。合成基因的部分寡核苷酸片段适当条件下退火得到模板—引物复合体在dNTP存在的条件下，通过Klenow酶将双链DNA的突出5′端补平，合成相应的互补链，再用相应的DNA连接酶修复缺口，获得两条完整的互补双链某种基因的化学合成过程示意图

从基因文库中获取目的基因基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。①基因文库的种类基因组文库：部分基因文库：包含一种生物的全部基因包含一种生物的一部分基因（如cDNA文库）②cDNA文库：某种细胞中转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段与适当的载体连接后导入受体菌，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为cDNA文库。

从基因文库中获取目的基因③基因文库的构建：a.基因组文库的构建供体生物→全部DNA→DNA片段→体外重组→受体菌群b.cDNA文库的构建供体生物→mRNA→cDNA→体外重组→受体菌群真核生物的基因结构及转录和加工过程图

从基因文库中获取目的基因基因组文库与cDNA文库的比较*文库类型基因组文库cDNA文库文库大小基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）基因中内含子（位于编码蛋白质的序列内的非编码的DNA片段）基因多少物种间的基因交流大小有无无有某种生物的全部基因某种生物的部分基因可以部分基因可以

从基因文库中获取目的基因④用DNA探针从基因文库中准确提取目的基因根据目的基因的核苷酸序列制成一段与之互补的核苷酸短链，并用同位素标记，即成为探针。用这一探针探查基因文库中已经变性的DNA片段（单链），如果有一个DNA片段能和探针片段互补而结合成双链（分子杂交），这一片段即含有所需要的基因。

利用PCR技术扩增目的基因①含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，是目的基因的体外扩增技术。PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。②原理：DNA半保留复制③条件：模板——原料——酶——DNA母链4种dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）（也可提供能量）热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）人工合成的DNA引物对——使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸）一定的