《分子生物学实验技术》课件：体外克隆与表达.pptVIP

《分子生物学实验技术》：体外克隆与表达;课程简介：体外克隆与表达的重要性;本讲内容概述：克隆与表达流程;第一部分：质粒载体的选择与准备;质粒载体的基本组成;常用质粒载体类型介绍;质粒载体的筛选标记;质粒的提取方法：碱裂解法;质粒的提取方法：柱纯化法;质粒质量检测：电泳检测;质粒质量检测：浓度与纯度测定;第二部分：目的基因的获取与处理;PCR扩增目的基因;引物设计原则与注意事项;PCR反应体系的优化;PCR产物的纯化与回收;限制性内切酶酶切目的基因;连接酶连接：目的基因与载体;连接反应体系的优化;连接产物的转化：感受态细胞准备;转化方法：热激转化;转化方法：电穿孔转化;转化后培养与筛选：抗生素筛选;蓝白斑筛选系统介绍;第三部分：重组质粒的鉴定;菌落PCR鉴定;限制性内切酶酶切鉴定;DNA测序鉴定;序列分析软件的使用;第四部分：基因表达系统的选择;原核表达系统：大肠杆菌;真核表达系统：酵母菌;真核表达系统：哺乳动物细胞;选择表达系统的考量因素;第五部分：蛋白表达的诱导与优化;诱导剂的选择：IPTG;诱导温度的控制;诱导时间的优化;细胞培养条件的影响;第六部分：蛋白的提取与纯化;蛋白的裂解方法：超声破碎;蛋白的裂解方法：酶解;蛋白的纯化方法：亲和层析;蛋白的纯化方法：离子交换层析;蛋白的纯化方法：凝胶过滤层析;第七部分：蛋白表达量的检测;SDS电泳;Westernblotting;ELISA;蛋白定量方法：Bradford法;蛋白定量方法：Lowry法;第八部分：蛋白功能的初步验证;酶活性测定;细胞功能分析;蛋白互作研究;第九部分：实验结果分析与讨论;实验数据处理;结果的统计分析;实验误差分析;第十部分：常见问题与解决方案