DB32T 2957-2016 鲤疱疹病毒Ⅱ型PCR检测方法.docxVIP

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备案号：51404-2016DB32

江苏省地方标准

DB32/T2957-2016

鲤疱疹病毒Ⅱ型PCR检测方法

PCRinspectionspecificationofcyprinidherpesvirusⅡ

2016-09-20发布2016-11-20实施

江苏省质量技术监督局发布

DB32/T2957-2016

I

前言

本标准按GB/T1.1–2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》要求进行编写。本标准由江苏省海洋与渔业局提出。

本标准起草单位：江苏省水生动物疫病预防控制中心。

本标准主要起草人：陈辉、袁锐、方苹、倪金俤、刘训猛、陈静、郭立新、吴亚锋

DB32/T2957-2016

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鲤疱疹病毒Ⅱ型PCR检测方法

1范围

本标准规定了鲤疱疹病毒Ⅱ型（cyprinidherpesvirusⅡ)检测方法的试剂和材料、仪器和设备、采样、检测步骤和结果判断。

本标准适用于鲫鱼疱疹病毒病病原的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法SC/T7014-2008水生动物产地检疫采样技术规范

3试剂和材料3.1水

符合GB/T6682-2008中一级水的规格。(该水用来配置规范性附录A中所列试剂)

3.2无水乙醇

3.3十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）

3.4TaqDNA聚合酶及配套的10×PCR缓冲液

TaqDNA聚合酶或ExTaqDNA聚合酶，生化试剂，-20℃保存。10×PCR缓冲液为该酶配套的相应反应缓冲液，生化试剂，-20℃保存。

3.5MgCl2（25mmol/L）：生化试剂，-20℃保存。

3.6dNTPs混合物

含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各10mmol/L的混合物，-20℃保存。3.75×TBE电泳缓冲液（按附录A的规定）。

3.86×DNA上样缓冲液（按附录A的规定）。

3.9引物及扩增片段

鲤疱疹病毒Ⅱ型DNA聚合酶基因扩增引物：P1：5’-CCCAGCAACATGTGCGACGG-3’，P2：5’-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3’。扩增片段大小为362bp。

注：该引物为扩增鲤疱疹病毒Ⅱ型DNA聚合酶基因的通用引物。

3.10DNA分子量标准

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宜使用DNAmarker2000，各片段大小依次为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp，也可使用其他合适的DNA分子量标准。

3.11阳性对照

阳性对照为已知受鲤疱疹病毒Ⅱ型感染，且PCR检测结果为鲤疱疹病毒Ⅱ型阳性并经测序验证的DNA模板，-20℃保存。

3.12阴性对照好

阴性对照为已知未受鲤疱疹病毒Ⅱ型感染，且PCR检测结果为鲤疱疹病毒Ⅱ型阴性的组织，提取DNA，-20℃保存。

3.13空白对照

灭菌双蒸水（无DNA酶）。

3.14核酸染色剂

GoldviewTM核酸染料或其他宜使用的核酸染料。

4仪器和设备

4.1台式高速离心机：最高转速可达12000rpm以上。

4.2普通冰箱：具有冷藏箱，-20℃以下冷冻箱体。

4.3PCR仪。

4.4电泳仪：输出直流电压0-600V。

4.5水平电泳槽。

4.6凝胶成像仪。

4.7水浴锅或者金属浴。

5采样

5.1采样数量

按SC/T7014-2008中6.1的规定执行。5.2个体要求

活鱼或濒死的鱼。

5.3采样部位

有临床症状的鱼，如体长不超过4cm，取鳃；体长为4cm~6cm，取鳃和内脏（包括肾）；体长大于6cm，则取脑、肝、肾、脾和鳃组织。

无症状的鱼取肾、脾、鳃和脑组织。性成熟雌鱼还需取卵巢液。

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5.4操作要求

5.4.1采样及样品前处理过程中