《卫生微生物学检验》课件——04-化妆品中铜绿假单胞菌的检测.pptxVIP

化妆品中

铜绿假单胞菌的检测

实验目的

2

了解铜绿假单胞菌的微生物学特性

掌握微生物实验技术基本原理及操作

熟悉铜绿假单胞菌的分离鉴定程序及方法

知识准备

3

铜绿假单胞菌惯称绿脓杆菌，为革兰氏阴性杆菌，属假单胞菌属。它在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在，在潮湿处可长期生存，对外环境的抵抗力比其他菌强，抗干燥的能力也强。

知识准备

4

形态：革兰氏阴性杆菌，菌体长短不一；单端单鞭毛；动力阳性；无芽胞

特性：专性需氧；生长温度范围是25℃~42℃，最适生长温度35℃，4℃不生长

知识准备

5

在血平板上形成大而扁平、湿润、有金属光泽、蓝绿色、透明溶血环菌落，有生姜味；

在普通平板、血平板、麦康凯平板上可形成5种不同形态的菌落

知识准备

6

菌落呈灰绿色，大小不一，扁平湿润，边缘不规则呈伞状伸展，表面常可见金属光泽

典型型（麦康凯平板）

知识准备

7

产绿脓素

琼脂染成黄绿色

典型型（普通平板）

知识准备

8

知识准备

9

菌落中央凸起

边缘扁平

表面粗糙

粗糙型（麦康凯平板）

知识准备

10

知识准备

11

生化特性

氧化酶：+

葡萄糖的氧化（O/F）：O

枸橼酸盐利用：+

精氨酸双水解：+

明胶液化：+

硝酸盐还原：+

乙酰胺酶：+

吲哚试验：-

知识准备

12

铜绿假单胞菌是常见的条件致病菌，在机体抵抗力低下，如AIDS、肿瘤、长期使用激素或免疫抑制剂等情况下易引起感染；

铜绿假单胞菌也是常见的医院感染病原菌，约10%的医院感染由本菌引起。

本菌可引起多种感染性疾病，如呼吸道感染，泌尿系统感染、皮肤感染、腹泻、中耳炎、角膜炎、心内膜炎、败血症等；

化妆品中微生物检验标准规定不得检出铜绿假单胞菌。

知识准备

13

实验方法

14

样品的前处理

亲水性样品（水包油型）：灭菌生理盐水

疏水性样品（油包水型）：

取样品先加10mL灭菌液体石蜡混匀，再加10mL灭菌的吐温80，在40-44℃水中震荡混匀10min，加入灭菌生理盐水75mL,在40-44℃水浴中乳化，制成1：10悬液；

或用均质器，将加有助溶剂、稀释液的样品放入均质器内，均质3-5min后，取上清液待检（上清液的稀释倍数为1:10）

实验方法

15

样品的前处理

膏、霜、乳剂半固体状样品

亲水性样品称取10g，加到灭菌的90mL生理盐水中，充分震荡混匀，放30-32℃水浴中静置15min；

疏水性的样品称取10g，放到灭菌的研钵中，加10mL霉菌液体石蜡，研磨呈粘稠状，再加10mL灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70mL灭菌生理盐水，在40-44℃水浴中充分混合，制成1:10的稀释液

实验方法

16

样品的前处理

固体样本

称取10g，加到灭菌的90mL生理盐水稀释瓶中，振荡混匀，使其分散混悬后，放30-32℃水浴中，15min后取出，充分震荡混匀，再放到30-32℃水浴中静置15min，取上清作为1:10的稀释液。

实验方法

17

增菌培养

取样品稀释液加到SCDLP液体培养基中，置于36℃±1℃培养18h-24h，如有铜绿假单胞菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色

a.空白对照

b.铜绿假单胞菌

SCDLP液体培养基培养结果

实验方法

18

分离培养

从培养液的薄膜处挑取培养物，划线接种在溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上，置于36℃±1℃培养18h-24h

菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素

实验方法

19

染色镜检

挑取可以菌落，涂片，革兰氏染色，镜检结果为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。

铜绿假单胞菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，呈红色杆状

实验方法

20

氧化酶实验

用接种环挑取铜绿假单胞菌可疑菌落涂在氧化酶试纸上，在30s内变为蓝色或蓝紫色为阳性，2min内不变色为阴性。

a.铜绿假单胞菌 b.大肠埃希菌

实验方法

21

绿脓菌素试验

a.大肠埃希菌b.铜绿假单胞菌

向试管中加入氯仿3-5mL，充分震荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿中,用吸管将氯仿转移到另一试管中并加入1M的盐酸1mL，振荡静置

实验方法

22

硝酸盐还原产气试验

挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在硝酸盐胨水培养基中，置于36℃±1℃培养24h±2h，观察结果

a.空白对照

b.大肠埃希氏菌

c.铜绿假单胞菌

小倒管中有气体，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。

实验方法

23

明胶液化试验

取铜绿假单胞菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置于36℃±1℃培养24h±2h，取出置于4℃±2℃冰箱10-30min,观察结果

a.空白对照

b.挑菌培养后

c.铜绿假单胞菌4℃放置后

d.大肠埃希菌4℃放置后

呈溶解状或表面溶解时即为明胶液化试