生物化学 Chapter 4 蛋白质的共价结构.ppt

（一）蛋白质测序的策略1.确定肽链数；2.拆分多肽链；3.断裂二硫键（过甲酸、巯基乙醇）；4.分析每一多肽链的氨基酸组成；5.分析N、C末端残基（FDNB、PITC）；6.裂解多肽链为小段肽；7.测定各肽段的氨基酸顺序；8.确定肽段的次序；9.确定二硫键的位置（对角线电泳）。（二）N-末端和C-末端

氨基酸残基的鉴定1.N-末端分析（1）二硝基氟苯（DNFB或FDNB）法：形成DNP-多肽，酸解后得到黄色DNP-氨基酸和游离氨基酸；（2）丹磺酰氯（DNS）法：DNS-氨基酸有荧光，灵敏度提高100倍，且不需提取；（3）苯异硫氰酸酯（PITC）法：PTH-氨基酸+剩余的肽链；（4）氨肽酶法：亮氨酸氨肽酶（LAP）。2.C-末端分析（1）肼解法：与肼反应生成氨基酸酰肼，再与苯甲醛作用形成不溶于水的二苯基衍生物沉淀，C-端氨基酸游离于水相。（2）还原法：用硼氢化锂将氨基酸还原成相应的?-氨基醇；（3）羧肽酶法：羧肽酶A和B混合使用，羧肽酶Y可单独使用。蛋白质氨基酸顺序的分析：

多肽链选择性降解——酶解法Sequenceofaminoacids二硝基氟苯DNFBor苯异硫氰酸酯PITC丹磺酰氯DNS6M苯乙内酰硫脲（三）二硫桥的断裂过甲酸氧化法巯基化合物还原法例:巯基乙醇(pH8-9)+8M尿素或6M盐酸胍处理,使S-S键还原为-SH,再用碘乙酸保护P172图4-8NHH2N-C-NH2HCl(盐酸胍)（四）氨基酸

组成的分析6MHCl于110?C下真空水解10-24小时,Trp被破坏;Ser,Thr,Tyr部分破坏;Asn,Gln水解成Asp,Glu;5MNaOH水解20h,可以定量Trp;甲基磺酸代替盐酸水解蛋白质（五)多肽链的部分裂解

和肽段的分离纯化1.酶裂解法(内肽酶—endopeptidases)(1)胰蛋白酶(trypsin)(2)糜蛋白酶(chymotrypsin)(3)嗜热菌蛋白酶(thermolysin)(4)胃蛋白酶(pepsin)(5)木瓜蛋白酶(papain)(6)葡萄球菌蛋白酶(Staphylococcalprotease)(7)梭菌蛋白酶(clostripain)蛋白质氨基酸顺序的分析：

多肽链选择性降解——酶解法蛋白质氨基酸顺序的分析2.化学裂解法：(1)溴化氰(Cyanogenbromide)水解法：其选择性的切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键(P175)。(2)羟胺断裂:NH2OH在pH9下断裂Asn-Gly肽键.(六)肽段氨基酸序列测定1.Edman化学降解法(P176)：能够重复循环，将肽链N-端氨基酸逐个进行标记和解离，可检测100个氨基酸残基。2.酶降解法：用外肽酶(exopeptidases)，只能测定末端附近几个氨基酸残基。3.质谱法：电喷射电离串联质谱仪（P178，图4-11）；4.根据核苷酸序列推定法：抗原蛋白抗体多核糖体mRNAcDNAA.A.sequencePTC苯异硫氰酸酯(七)肽段在多肽链中次序的决定重叠肽(overlapingpeptide)两种以上的断裂多肽的方式确定多肽链的氨基酸序列例：P179(八)二硫桥位置的确定胃蛋白酶水解对角线电泳(diagonalelectrophoresis)两次电泳间隙用过甲酸蒸汽熏蒸蛋白质是生物功能的执行者。蛋白质的功能蛋白质功能的多样性

Biologicalfunctionsofproteins（1）催化功能——酶,抗体酶；核酶（ribozyme)是核酸，而不是蛋白质；（2）?运输与储藏功能，如血红蛋白输送氧，肌红蛋白为肌肉输送氧，运铁蛋白负责在血浆中输送铁离子；跨膜蛋白主动运输；细胞色素C传递电子；卵清蛋白、酪蛋白储藏氨基酸；（3）运动功能，如肌球蛋白（myosin）和肌动蛋白（actin）引起肌肉伸缩；细菌的鞭毛或纤毛蛋白推动细胞运动；（4）免疫功能——抗体（antibody），血液凝固蛋白，毒蛋白；（5）信号传递功能——受体蛋白（receptorprotein)；（6）调控功能——细胞因子，激素；组蛋白，阻遏蛋白（repressor）；（7）建筑构件（支架）——胶原纤维蛋白，细胞膜的组成部分；（8）异常功能——乐果甜蛋