植物组织培养第七章植物原生质体培养及细胞融合.ppt

1、平板（固体包埋）培养（一）培养方法原生质体纯化后，离心，用培养基稀释至一定密度，再与0.6%琼脂或低溶点琼脂糖（37?C左右）混合，培养于培养皿中。1.1饲养层培养方法一：X-射线杀死原生质体，与生活力正常的原生质体混合，加入0.6%琼脂，制成混合液，培养于培养皿中。方法二：X-射线杀死原生质体，与0.6%琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作饲养层，再将生活力正常的原生质体与0.6%琼脂混合，培养于饲养层上。前者为后者提供生长因素或成分未知但能促进生长的扩散型化学物质将生长迅速的原生质体培养物与难于培养的原生质体混合共培养法2、液体浅层培养陈传红制作2007/5用培养基离心用培养基悬浮固体培养基培养皿底部铺一层固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。3、固－液共培养固体培养基中的成分可以向液体培养中释放，培养物产生的有害物质，也可被固体部分吸收。（二）影响原生质体培养的因素陈传红制作2007/5原生质体的活力起始密度渗透压稳定剂培养基成分培养条件植物材料和基因型第一次分裂（三）原生质体再生（Regeneration）再生细胞壁荧光增白剂（卡氏白)圆变为椭圆形第二次分裂第N次分裂小细胞团肉眼可见的细胞团愈伤组织肉眼可见细胞团陈传红制作2007/5愈伤组织愈伤组织器官发生途径胚胎发生途径植株是以原生质体培养技术为基础，借用动物细胞融合方法发展和完善起来的一门新型生物技术，又称体细胞杂交。不同原生质体之间互相融合，发生胞质基因重组和/或核基因重组。第三节原生质体融合原生质体融合；选择融合体；杂种植株的再生和鉴定。技术体系的3个环节：1、原生质体融合意义陈传红制作2007/5克服杂交不亲合克服生殖器官败育克服柑桔多胚2、成就陈传红制作2007/51972年Carlson建立第一株烟草体细胞杂种。011975年柑桔原生质体培养成功；01现有：苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、番茄、矮牵牛等作物的原生质体培养成功；木本植物中柑桔最为成功。01番茄+马铃薯？陈传红制作2007/53、融合方法陈传红制作2007/5自发融合(Spontaneousfusion)诱发融合(inducedfusion)NaNO3PEG物理和化学方法高pH-高Ca离子电场融合01NaNO3法1909年：Kuster证实引起亚原生质体融合1970年：Power报道可重复控制原生质体融合0203041972年：Carlson诱导原生质体融合获得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起不足：诱导频率不高。05063.2高pH-高Ca离子法陈传红制作2007/51973年：Keller和Melchers用pH10.5的50mMCaCl2溶液在37℃时，诱发烟草叶肉原生质体融合。优点：杂种产量高。不足：高pH值对细胞有毒害作用。3.3PEG法陈传红制作2007/5PEG：PolyethyleneGlycol（聚乙二醇）1974年：KaoKN和Michayluk采用此法大大提高融合频率。1976年：Kao发现用高pH和高Ca结合融合频率更高。用高钙强碱溶液代替培养基清洗PEG。PEG法特点：01融合频率高可重复性强02毒性较低03诱发融合无特异性植物+植物植物+动物动物+酵母04PEG法原理：1PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚；在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。2-+-+桥梁++--PEG被洗掉++--电荷重排++--原生质体膜接触++-融合示意图电融合法Senda1979年首先利用此方法实现原生质体融合电融合仪中有一个融合室，小室两端装有电极，一定密度的原生质体悬浮液置于其