第七章中药制剂检测新技术讲解.pptx

;;聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）是一种在体外特异性地扩增已知基因的生物学技术，是在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术。

PCR技术已广泛用于生命学科、医学工程、遗传工程、疾病诊断、法医学、考古学、医药及食品等领域

;（1）基本原理

●模板DNA在高温下双链解开为单链状态（变性）；降低温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为复性（退火）；再将温度升至合适温度，在TaqDNA聚合酶的催化下，以四种脱氧核苷酸（dNTP）为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段（延伸）。该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以指数倍增。

;（1）基本原理

●中药分析中利用这一原理，将经过PCR扩增的供试品药材和对照药材的DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳法检测，供试品凝胶电泳图谱中与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上应有相应的DNA条带。从而对供试品的真伪进行鉴别。;（2）主要特点

●特异性强

●灵敏度高

●快速简便

●模板纯度要求低

;（1）主要仪器

●正文内容PCR扩增仪、电泳仪、紫外透射仪、凝胶成像系统或照相系统、高速离心机（转速可达12000rpm/min及以上）、研钵、移液器、一次性移液枪头、微量离心管等。

;（2）常用试剂

●供试品、对照药材、DNA提取试剂盒、TaqDNA聚合酶、四种dNTP底物、鉴别引物、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）、RNA酶、蛋白酶K、琼脂糖、各种缓冲液、三羟甲基氨苯甲烷（Tris）、乙二胺四醋酸（EDTA）、无水乙醇、苯酚、氯仿、异丙醇、液氮、Mgcl2、Hcl等。;（1）模板DNA的提取

①传统DNA提取方法

●CTAB法

●SDS法

②试剂盒法

③提取注意事项;（2）PCR反应

①反应体系

●在微量离心管中加入适量的PCR反应缓冲液、模板DNA、鉴别引物、dNTP底物、TaqDNA聚合酶、二氯化镁、无菌超纯水等。

②PCR反应

●将微量离心管置PCR仪中，设置PCR反应参数：变性、退火、延伸反应的温度、时间，???环反应次数，进行PCR扩增反应。反应完毕，应立即进行琼脂糖凝胶检测或将PCR产物4℃保存。;（2）PCR反应

③标准的PCR反应分为三步：

●变性（90℃～96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

●退火（60℃～65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

●延伸（70℃～75℃）：在TaqDNA聚合酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以四种dNTP为原料，以引物为起始点进行延伸，合成与模板互补的DNA链。

●变性、退火和延伸三步为一个循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板，DNA含量成指数级增加，30个循环后，扩增倍数一般可达106～107。;（2）PCR反应

●有的样品在PCR反应结束后，还需要在PCR反应液中加入适当的限制性内切酶，进行酶切反应，用酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，这就是在PCR技术基础上发展起来的聚合酶链式反应—限制性内切酶长度多态性（PCR-RFLP）分析技术。该技术是通过PCR扩增一段DNA片段，然后在选择适当的限制性内切酶，消化PCR产物，经电泳，可得到特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基因型的目的。

;（3）电泳检测

●电泳是分离和纯化DNA片段的最常用的技术。PCR反应中的DNA电泳检测，常采用琼脂糖凝胶电泳法。

●操作方法：

①配制琼脂糖凝胶

②对照品溶液及供试品溶液的制备

③点样与电泳

④凝胶成像分析

●2015年版《中国药典》中规定，琼脂糖凝胶电泳法（通则0541）适用于检测DNA，PCR反应中的电泳检测，方法见各品种项下。;（1）川贝母的聚合酶链式反应—限制性内切酶长度多态性方法鉴别

（2）乌梢蛇饮片的聚合酶链式反应法鉴别;小结