体外转录与翻译课件.ppt

体外转录与翻译基因体外转录与翻译五、基因体外翻译的应用1、基因产物的检测???目前应用的最普遍的可能就是这个用途，在获得一段DNA序列后，通过启始密码子ATG（少数情况是GTG）和终止密码子（TAA、TAG或者TGA）初步判断为开放读码框（ORF）。利用快捷的体外表达可迅速确定此序列是否有表达产物、表达产物的特性等第一手信息。对于一次检测多个ORF产物，这个方法尤为方便。体外转录与翻译基因体外转录与翻译五、基因体外翻译的应用2预合成高通量蛋白表达和纯化?????在进行体内表达前往往先进行体外表达，因为体外表达可以表达一些毒性强、对水解敏感或者不稳定的蛋白。另外，体外表达另一个优势就是可以合成时插入带有光敏性、荧光或者生物素残基等标记，方便对蛋白进行定位。一个典型的体外表达系统产量大约是50μl，现在随着技术的改进许多公司的产品表达量也可以达到毫克级。体外转录与翻译基因体外转录与翻译五、基因体外翻译的应用???3高通量筛选筛选病毒特异翻译抑制复合物筛选分子伴侣抑制药物*确定新型的孤受体（orphanreceptor）体外转录与翻译基因体外转录与翻译五、基因体外翻译的应用???4分子结构和定位分析*膜蛋白研究?曾经有实验证明在体外表达系统中加入犬类的微粒体膜可以让跨膜蛋白G蛋白偶连受体正确折叠。*加入非天然氨基酸进行标记?有实验表明经过修饰的带赖氨酸反密码子的tRNA可以将非天然的氨基酸插入到体外表达合成的多肽中。*蛋白折叠和分子伴侣相互作用研究*实时翻译/折叠实验*高分子组装体外转录与翻译基因体外转录与翻译五、基因体外翻译的应用???5分子诊断*蛋白截短实验（Proteintruncationtest，PTT）这项实验发明1993年，可快速检测出基因突变。体外转录与翻译基因体外转录与翻译五、基因体外翻译的应用???6功能基因组学体外表达克隆*核糖体展示技术?RibosomalDisplay，RD体外转录与翻译基因体外转录与翻译五、基因体外翻译的应用???7功能研究*酶活分析?有些蛋白通过体外表达方式仍然保持活性，因此可以应用这些样品进行酶活测定。如果在体外表达系统中不含有与待测定酶相同的酶活性，那么表达产物无需纯化就可以直接进行测定。另外，在体外表达系统中可以方便加入一些外部因子，从而可能省去一些要在细胞中进行的研究。*突变分析*翻译后修饰分析?许多蛋白需要进行高级修饰后才能形式功能。目前，在兔网织红细胞系统中已经成功进行过磷酸化、腺苷酸化、豆蔻酰化、法呢醇化、异戊二烯化和蛋白水解活性修饰。额外的微粒体膜则可以对糖基化、甲基化和信号序列去除进行研究。体外转录与翻译基因体外转录与翻译五、基因体外翻译的应用???8分子间相互作用检测*蛋白－蛋白相互作用?这些作用包括特异结合（例如：抗原－抗体、配体－受体结合），高分子组装（macromolecularassembly）和转录功能复合物的形成。通常相互作用的蛋白分别用体内表达系统和体外表达系统表达，利用体外表达可方便的对蛋白进行标记，以此为探针检测另一蛋白。利用这个方法还可以对酵母双杂交的结果进行验证。*蛋白－DNA和蛋白－RNA相互作用?表达的蛋白可以通过电泳迁移率移位实验（electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA）发现蛋白是否能够与核酸结合，结合后的蛋白泳动会较慢。*DNA-RNA和RNA-RNA相互作用?互补的核酸序列会抑制转录或翻译的进行。体外转录与翻译基因体外转录与翻译???课后复习重点1、体外转录常用的RNA聚合酶2、体外转录模板DNA来源以及要求3、体外翻译常用的翻译系统4、体外翻译对于ＭＲＮＡ要求*体外转录与翻译*主讲人:杜珍武E-mail:phdzh.cn吉林大学药学院基因工程教研室GeneticEngineering体外转录与翻译基因体外转录与翻译invitro