ELISA原理、方法、操作及注意事项.ppt

ELISA;1.ELISA的原理;2.ELISA的类型;根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法;双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法;双抗体夹心法测抗原;间接法测抗体

间接法测抗体主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

;间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反响的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血液中的抗E.Coli抗体发生反响。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反响的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反响。另外如抗原中含有无关蛋白也会因竟争吸附而影响包被效果。

;间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性IgG。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小局部。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的外表。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质〔例如牛血清蛋白〕再包被一次，以封闭固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释〔1:40~1:200〕，以防止过高的阴性本底影响结果的判断。

;间接法测抗体;双抗原夹心法测抗体

双抗原夹心法与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗?HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找适宜的标记方法。

;双抗原夹心法测抗体;Titleinhere;竞争法测抗体;竞争法测抗体;竞争法测抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

;竞争法测抗原;捕获包被法

在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。;捕获包被法测抗体

;ABS-ELISA法

;ABS-ELISA法

;3.ELISA的操作;一、加样

在?ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。有的测定〔如间接法ELISA〕需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中参加稀释液，再在其中参加血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。

;〔1〕标本

可用作ELISA测定的标本十分广泛，大局部ELISA检测均以血清为标本。血清标本按常规方法采集，应注意防止溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。

;;〔2〕酶

ELISA中所用的酶要求纯度高、催化反响的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保存着它的活性局部和催化能力。最好在受检标本中不存在与标记酶相同的酶。另外它的相应底物应易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定，光吸收高。;在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)和碱性磷酸酶(alkalinephosohatase,AP)。在少数商品ELISA试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。

国产?ELISA试剂一般都用HRP制备结合物。HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶〔酶蛋白〕和辅基〔亚铁血红素〕结合而成，是一种卟啉蛋白质。主酶无色糖蛋白在275nm波长处有最高吸收峰，辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。HRP的纯度用RZ(ReinheitZahl，德文，意为纯度数〕表示，是403nm的吸光度与280nm吸光度之比，高纯度的HRP的RZ≥3.0。

;;OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反响后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是H