总RNA提取定量与RTPCR.ppt

原理提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。（一）反转录酶的选择鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。在长时间的逆转录过程中，不会造成模板的降解，获得cDNA的几率大，适用于较长的cDNA链的合成。禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。MMLV反转录酶的RNaseH-突变体：商品名为Superscript和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。1234（二）引物的选择随机六聚体引物：用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。特异性引物：是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。（三）内参的设定常用的内参有GAPDH（3-磷酸甘油醛脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一、各孔间的温度差等所造成的误差。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参照基因的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。仪器和主要试剂基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管总RNA第一链cDNA合成试剂盒（含有逆转录酶、RNA酶抑制剂、缓冲液）dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mmol/L操作步骤采用TaKaRaPrimeScriptRTreagentkit进行cDNA第一链合成：按下列组分配制RT反应液5XPrimeScripBuffer2μlPrimeScriptRTEnzymeMix0.5μlOligodTPrimer(50μM)0.5μlRandom6mers(100μM)0.5μlRNasefreeH2O1.5ulTotalRNA5μl反转录反应条件如下37℃15min（反转录反应）85℃5sec（反转录酶失活反应）注：反转录步骤在PCR仪中进行RNA酶污染的预防收藏RNA的化学性质比DNA活跃得多。RNA分子上紧邻磷酸二脂键的2′羟基基团能直接被RNA酶利用来作为活性因子，从而使得RNA酶无需金属离子就能发挥活性。由于RNA酶在环境中广泛存在，特别是RNaseA，结构极其稳定，不能通过高温高压灭菌失活，因而极难消除，对保持RNA样品的完整性构成极大的威胁。由于RNaseA类酶依赖于活性位点处的组氨酸残基起催化作用，因此能被组氨酸烷化剂DEPC所抑制。OD值(opticaldensity)表示某一物质在某一个特定波长下的吸光度.

在分析化学里,某一化学物质都可吸收一定波长的光,并且对光的吸收度与这样化学物质的浓度成正比.因此可以利用吸光度的大小来测定某种物质的浓度.***核酸为两性分子,在pH3.5时，整个分子带正电,pH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。总RNA的提取、定量与RT-PCR目的完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA