胰岛素的制备.ppt

温度诱导表达筛选：挑取转化的单菌落，37℃培养过夜，次日扩大10倍37℃培养3h，42℃诱导4—6h。离心得菌体，适量无菌水悬浮后，取适量菌体悬浮液进行15％SDS—PAGE，以pBV220和pJGl03转化菌液作为对照．DNA序列测定：采用izard?plusMiniprepsDNApurificationSystem提取测序模板，采用Sanger双脱氧终止法，测序反应按Pharmacia公司T7SequencingTMKit说明书进行．6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析．第31页，共43页，星期日，2025年，2月5日关于胰岛素的制备第1页，共43页，星期日，2025年，2月5日必要性胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因子居有高度生物活性，分子量很大，立体结构异常复杂，体外难以人工合成。所以过去糖尿病患者只能服用从牛、猪体中提取的胰岛素来治疗；但牛、猪胰岛素结构上与人胰岛素有差别，如与猪胰岛素B链第30个基酸残基不同，长期服用会引起肾和眼的疾病，故必需要用基因工程方法获得重组人胰岛素进行治疗。第2页，共43页，星期日，2025年，2月5日第3页，共43页，星期日，2025年，2月5日原理基因工程技术主要内容或步骤可分为目的基因制备和分离，构建DNA重组体；DNA重组体扩增和表达，重组体筛选和鉴定；外源基因表达，产物分离纯化和鉴定以及将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之在新的遗传背景下次进行功能性表达，生产出人类所需要的物质。第4页，共43页，星期日，2025年，2月5日预想把人的胰岛素的基因提取出来，接在一个小的载体上，得到一个重组的载体，再转化到真核细胞，细胞并不认为是人的基因就不管它，会当成自己的基因进行胰岛素的合成，每一个细胞就相当于生产胰岛素的工厂，实际上我们可以通过改变胰岛素基因前面的调控序列，让细胞停止合成其他的蛋白质，只合成胰岛素。第5页，共43页，星期日，2025年，2月5日但是胰岛素的A链、B链分别表达后如何使其正确连接成了人们关注的问题。第6页，共43页，星期日，2025年，2月5日人胰岛β细胞生成胰岛素过程主要分为三个阶段：第一步，机体首先合成由109个氨基酸组成的前胰岛素原。第二步，前胰岛素原脱去23个氨基酸，转变成含有86个氨基酸的胰岛素原。胰岛素原分子量为9000，是长的单链，含胰岛素的A链和B链及连接链。第三步，胰岛素原再脱去4个碱基氨基酸，生成含31个氨基酸的C肽及含51个氨基酸的胰岛素分子。第7页，共43页，星期日，2025年，2月5日第8页，共43页，星期日，2025年，2月5日用E.coli做表达系统

及A链、B链分别表达的问题 E.coli是原核生物没有真核生物翻译后加工、修饰。E.coli中表达的小分子外源蛋白不稳定。E.coli与人的种属差异较大，有密码子的偏好性。A链、B链间二硫键正确连接和其空间构象正确形成较难。第9页，共43页，星期日，2025年，2月5日一些解决办法替换表达系统,换为酵母或动物细胞等真核表达系统。仍用E.coli作为表达系统，将胰岛素基因与一些较大的蛋白分子的基因适当连接，使表达的蛋白分子量足够大，避免被蛋白水解酶分解，提高其稳定性及表达率。在A链、B链间加入C链或其功能类似物，使胰岛素能够形成正确的空间构象。第10页，共43页，星期日，2025年，2月5日一、人胰岛素原在Pichiapastoris

（毕赤酵母）中的表达毕赤酵母是一种甲醇营养酵母，用酵母合成胰岛素的主要优点是可以进行体内加工形成二硫键的正确配对，产物分泌到培养基中，下游纯化比较简单。甲醇诱导醇氧化酶(AlcoholOxidase)，AOX的表达是在转录水平上调控的，其启动子(PAoxl)属诱导型启动子，能非常有效的控制外源基因的表达。不仅能克服强启动子在宿主细胞内大剂量表达外源蛋白，会导致宿主细胞受损，甚至死亡的缺点，而且能高水平表达。第11页，共43页，星期日，2025年，2月5日材料与方法

1．材料1．1菌种和质粒E.coli、JMl09、SMDll68，质粒pUCl8、pHIL—S11．2限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、