植物病原细菌学实验.pptVIP

接菌：将细菌接种于淀粉琼脂平板上，适温下培养24-48小时。01结果观察：在平板上加碘液后，培养基为深兰色，菌落周围有无色透明圈者为阳性。013.淀粉水解试验四、细菌的好氧性和厌氧性测定蛋白胨2.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钾0.2g琼脂3.0g蒸馏水1000.0mlpH7.4~7.8溴百里酚兰（1.6％酒精溶液1.5ml）待培养基融化，并调pH后，装于试管中，每支试管装9ml灭菌。培养基凝固后，用接种针蘸细菌悬浮液针刺接种，一直刺到管底。分别在培养2、4和7d后观察记录。好氧性细菌，只在开管的上部生长；兼性厌氧性细菌，则在开管的上下部都能生长；厌氧性细菌，则只能在开管的下部和闭管中生长。（五）其他生理生化试验1）试剂：1%二甲基对苯二胺盐酸盐或1%四甲基对苯二胺盐酸盐。2）测定方法：1.氧化酶试验A.Kovacs：在培养皿内放一张滤纸，滤纸上加3-4滴试剂使其湿润，用牙签挑取24h菌苔涂在滤纸上，60秒内变成紫色为阳性反应，60秒后或不便色为阴性。B.滤纸条法：用滤纸条蘸少许菌苔，加1d试剂，立即呈粉红色为阳性试剂：3%过氧化氢01测定方法：挑取固体培养基上培养24-48h的菌苔，置于干净玻片上，滴加过氧化氢。02过氧化氢酶（接触酶）试验03结果观察：在半分钟内有大量气泡产生的为阳性，不产生气泡的为阴性。04作业：01若有吲哚和硫化氢产生，其实验的试管口上的滤纸条会发生什么样的颜色变化，为什么？在石蕊牛乳不能和其他细菌培养基一起灭菌，为什么？反应中会出现多种不同的反应，试分析其发生的原因？观察和记录细菌氧化发酵试验、MR试验以及接触酶试验结果。02实验五植物病原细菌的PCR分子鉴定?1了解PCR反应的原理；掌握PCR反应的操作方法。2一、实验目的PCR扩增聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）1、PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与目标序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链（以便它与引物结合，为下轮反应作准备）；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。表面消毒：将切取的组织块在70％乙醇中浸一下立即取出，然后用表面消毒剂进行表面消毒，可以采用0.1％升汞，15″－2min或0.5％的次亚氯酸盐如漂白粉（1：9稀释液）2min01消毒后用灭菌水洗涤3次，将病组织放在另一个培养皿的灭菌水中，剪破中心或以灭菌玻璃棒研碎病组织静置20－30分钟，等细菌游出。0201将茎部剪成1－2寸长，表面用70％酒精轻拭，在火焰上表面消毒，以灭菌刀纵剖，选择轻微变色病部，以灭菌刀切出薄片或以解剖针挑出病健交界处组织（可以不再消毒），加灭菌水浸泡20-30分钟。02如果茎部较粗，也可以在表面消毒后用解剖刀横断茎部，用夹子或手紧压茎部横断面，挤出溢脓或汁液。（2）萎蔫型如茄青枯病由于细菌位于表皮细胞和木质部之间，因此应用酒精棉花擦拭表面，在火焰上表面消毒，再在灭菌皿中实行解剖后以灭菌玻棒将其捣碎，静置浸泡24h。02软瘤比较容易分离；木质瘤可以磨碎后接种在向日葵、番茄等幼株上长出瘤后再分离。01（3）肿瘤组织（4）腐烂组织较简单，选择近病部交界处以接种环挑取少量腐烂组织，稀释。（5）种子带菌的分离选择病种子，以0.1％升汞液表面消毒1－2min，灭菌水洗涤，再将此种子在70％酒精中浸几分钟，洗涤2－3次，取出放在研钵中磨碎，离心取上清液。分离方法01A.倒平板：注意培养基的温度不能太高，否则冷凝水太多，细菌在水中游动而影响单个分散菌落的形成。02平板划线分离法：被普遍采用03B.用接种环蘸取上述配制好的菌悬液，在已凝固的平板培养基表面划线如果菌液浓度大，培养皿转动角度减小，增加划线的次数划4条线后，将接种环灭菌，培养皿转动90°，从第2条线开始