第三章 蛋白质的通性、纯化和表征课件.ppt

第三章蛋白质的通性、纯化和表征2.疏水作用层析以苯基琼脂糖或辛基琼脂糖为固体支持物，与蛋白质表面的疏水区相互作用，用降低离子强度或增加置换剂的方法洗脱。常用的置换剂有非离子型去污剂、脂肪醇、脂肪胺等。疏水作用层析容易引起蛋白质变性，在蛋白质分离中使用不广。第三章蛋白质的通性、纯化和表征(五)利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。主要的有：酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体、DNA与结合蛋白等。在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液中的另一方分子进行亲和层析，达到分离纯化目的。例如，酶与其辅酶是成对互配的，既可把辅酶作为固定相，使样品中的酶分离纯化，也可把酶作为固定相，使样品中的辅酶分离纯化。第三章蛋白质的通性、纯化和表征第三章蛋白质的通性、纯化和表征第三章蛋白质的通性、纯化和表征(六)高效液相层析和快速蛋白液相层析高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)，又称高压液相色谱法、高速液相色谱法、现代液相色谱法等，是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的分析技术。特别适用于高沸点、不能气化或热稳定性差的有机物分离分析，在生物化学与分子生物学中的应用日益广泛。第三章蛋白质的通性、纯化和表征HPLC在高压下使液体通过色谱柱，在室温条件下分离混合组分，经检测器转变成电信号，由记录器描记或数据处理装置显示测定结果，具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点。1.高压：由于HPLC是以液体作为流动相，而液体比气体通过色谱柱时所受的阻力要大得多，所以必须施加高压，一般为15-30MPa，最高可达50MPa。2.高速：由于HPLC采用了高压，使流动相液体的流速加快，一般分析周期为数分钟至数10分钟，比经典的液相柱色谱要快得多，但比GC稍慢。3.高效：由于HPLC的柱效较高(每米塔板数可达5000)，有时一根柱子可分离数十种乃至上百种组分。4.高灵敏度：采用灵敏的检测器和自动化装置，可检出10-9g乃至10-11g的物质；所需试样量很少，通常只需数十微升试样即可进行全分析。由于HPLC具有以上特点，所以70年代以来得到了迅速的发展。一般认为，对于有机物的色谱分析，当其相对分子质量小、沸点较低时，可用GC进行分析；沸点较高(＞450℃)、不能气化或热稳定性差者，可用HPLC分析；如果条件不允许，无法购置昂贵的仪器时，可用TLC等经典液相色谱进行分析。第三章蛋白质的通性、纯化和表征六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定(一)蛋白质含量测定1.凯氏定氮法2.双缩脲法3.酚试剂法4.紫外吸收法5.染料结合法6.胶体金法7.免疫学方法8.生物活性测定法(二)蛋白质纯度鉴定常用电泳法、HPLC法、免疫学方法等第三章蛋白质的通性、纯化和表征基本要求1.掌握蛋白质的酸碱性质。2.掌握测定蛋白质相对分子质量的常用方法。3.掌握蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀的方法和原理。4.掌握蛋白质分离纯化的一般原则。5.熟悉蛋白质分离纯化的常用方法。6.掌握蛋白质含量测定与纯度鉴定的常用方法。作业题1.第317页第1题；2.第317页第2题；3.第317页第3题；4.第317页第5题；5.第317页第6题；6.第317页第7题；7.第317页第8题；8.第317页第10题；9.第250页第12题。*****第三章蛋白质的通性、纯化和表征样品中各组分的流出顺序，可用分配系数Ka来量度：Ka=(Ve-Vo)/Vi式中Ve：为洗脱体积(elutionvolume)，表示某一组分从层析柱洗出到最高峰出现时，所需的洗脱液体积；Vo：外体积(outervolume)，为层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积。Vi：内体积(innervolume)，为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积。当某组分的Ka=0时(即Ve=Vo)，说明该组分完全不进入凝胶颗粒微孔，洗脱时最先流出。若某组分的Ka=1(即Ve=Vo+Vi)时，说明该组分可自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，洗脱时，最后流出。Ka在0-1之间的组分，洗脱时Ka值小的先流出，Ka值大的后流出。第三