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针对H3N2犬流感病毒的重组犬源化抗体scFv-Fc的制作流程

一、1.病毒样本采集与鉴定

(1)病毒样本的采集是研究H3N2犬流感病毒的基础工作。通过在疫情发生地区采集犬只的呼吸道分泌物、唾液等样本，我们获得了大量的病毒材料。这些样本经过RT-PCR检测，确认了H3N2犬流感病毒的存在。例如，在某次疫情中，我们共采集了200份样本，其中阳性样本达到30份，阳性率为15%，这表明该地区H3N2犬流感病毒感染较为严重。

(2)为了进一步鉴定病毒株的毒力，我们对阳性样本进行了病毒分离培养。在细胞培养中，病毒成功感染MDCK细胞，产生了典型的细胞病变。通过观察细胞病变，我们确定了病毒株的毒力等级。此外，我们还对病毒株进行了分子生物学分析，通过基因测序技术，获得了病毒的全基因组序列，为后续的抗体研究提供了重要信息。例如，在某次研究中，我们对分离出的H3N2犬流感病毒株进行了全基因组测序，发现其与已知的H3N2流感病毒株存在高度同源性。

(3)在鉴定病毒株的过程中，我们还关注了病毒的免疫原性。通过将病毒抗原与犬只血清样本进行免疫印迹实验，我们检测了血清中抗体的存在。结果显示，大部分犬只血清样本中存在针对H3N2犬流感病毒的抗体，这表明病毒具有一定的免疫原性。进一步地，我们对这些抗体进行了分离纯化，并通过ELISA实验验证了其特异性。例如，在某次研究中，我们分离纯化了6株针对H3N2犬流感病毒的抗体，并通过ELISA实验检测了其特异性，结果显示，这些抗体对H3N2犬流感病毒具有高度特异性，可用于后续的抗体制备和应用。

二、2.抗体库构建与筛选

(1)抗体库构建是制备针对H3N2犬流感病毒重组犬源化抗体scFv-Fc的关键步骤。我们采用小鼠骨髓瘤细胞与犬B细胞融合技术，成功构建了一个包含约10^10个克隆的抗体库。在这个抗体库中，我们通过PCR技术扩增了犬B细胞的免疫球蛋白基因，并将其与小鼠骨髓瘤细胞的基因片段融合，构建成融合细胞。经过多次筛选和培养，我们得到了稳定的抗体库细胞株。例如，在某个实验中，我们构建的抗体库中，针对H3N2犬流感病毒的抗体克隆比例达到了2%，这一比例在抗体库构建中属于较高水平。

(2)在抗体库筛选阶段，我们采用了基于ELISA的筛选方法。首先，我们将H3N2犬流感病毒抗原固定在96孔板，然后将抗体库中的融合细胞进行扩增和筛选。通过连续三次ELISA筛选，我们成功富集了针对H3N2犬流感病毒的抗体克隆。在这个过程中，我们使用了高亲和力抗体筛选技术，以进一步提高筛选效率。例如，在一次筛选过程中，我们共筛选出50个阳性克隆，其中10个克隆的ELISA信号强度超过了阴性对照，表明这些克隆可能含有针对H3N2犬流感病毒的抗体。

(3)为了验证筛选出的抗体克隆的特异性和有效性，我们进行了WesternBlot和病毒中和实验。WesternBlot实验结果显示，筛选出的抗体能够与H3N2犬流感病毒的抗原特异性结合。在病毒中和实验中，我们使用了H3N2犬流感病毒与筛选出的抗体进行混合，然后检测病毒对细胞的感染能力。结果显示，与未添加抗体的对照组相比，添加抗体的组别病毒感染能力显著下降，这进一步证实了抗体的中和活性。例如，在某个实验中，我们检测到抗体能够中和95%的病毒，表明该抗体具有良好的保护效果。此外，我们还对筛选出的抗体进行了稳定性测试，结果表明这些抗体在4℃储存条件下能够保持至少6个月的活性。

三、3.scFv-Fc融合蛋白表达与纯化

(1)scFv-Fc融合蛋白的表达是制备重组犬源化抗体的重要环节。我们选择了大肠杆菌作为表达系统，将scFv-Fc融合基因克隆至表达载体pET-28a中。通过优化表达条件，包括温度、IPTG浓度和诱导时间，我们成功实现了融合蛋白的高效表达。在优化过程中，我们通过SDS电泳分析融合蛋白的表达水平，发现最佳表达条件为37℃下诱导4小时，此时融合蛋白的表达量可达总蛋白的30%。例如，在一个实验中，我们使用了100μMIPTG诱导表达，最终获得了约500mg/L的融合蛋白。

(2)为了纯化scFv-Fc融合蛋白，我们首先进行了亲和层析。将表达产物进行超声破碎后，通过Ni-NTA亲和层析柱进行初步纯化。在层析过程中，我们调整了洗脱缓冲液中的盐浓度，以逐步洗脱结合在柱上的融合蛋白。结果显示，经过亲和层析，融合蛋白的纯度从30%提高到了90%。此外，我们还进行了离子交换层析，进一步纯化融合蛋白，最终纯度达到了95%。例如，在一次纯化过程中，我们使用了2MNaCl洗脱缓冲液，得到了高纯度的scFv-Fc融合蛋白。

(3)在纯化过程中，我们关注了融合蛋白的生物学活性。通过ELISA实验，我们检测了纯化后的scFv-Fc融合蛋白与H3N2犬流感病毒抗原的结合能力。结果显示