第二章 基因工程制药-1课件.ppt

第二章基因工程制药-1逆转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA克隆表达。1、mRNApurification细胞内含有三种RNA，mRNA占RNA总量的2%-5%，相对分子量大小不一致，分离困难。但是mRNA的3’末端常含有一polyA组成的末端，长达20-250个腺苷酸，足以吸附于Oligo-纤维素上，从而可以用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA上分离出来，可得到纯度较高的mRNA。逆转录法第二章基因工程制药-1逆转录法TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAOligo(dT)纤维素Poly(A)--Oligo(dT)100mMNaCl洗脱rRNA/tRNA10mMTris1mMEDTAPoly(A)mRNATotalRNA纤维素柱纯化Poly(A)mRNA流程图第二章基因工程制药-12、cDNA第一链的合成：寡聚脱氧胸苷酸为引物，逆转录酶催化，合成互补DNA。3、cDNA第二链的合成：除去mRNA，cDNA第一链为模板。4、cDNAcloning：expressionvectorpUC5、将重组体导入hostcell6、cDNAlibraryidentification7、目的cDNA克隆的分离和鉴定（限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因的转录方向、转录起始点等。）逆转录法第二章基因工程制药-1Polymerasechainreaction的要求是，对基因片段两侧的序列了解清楚。通过针对这两个已知区域的DNA引物，在Taq酶催化下，进行2n指数递增方式的扩增，获得大量的DNA片段。变性95?C延伸72?C退火Tm-5?CRT-PCR第二章基因工程制药-1RT-PCR第二章基因工程制药-15?Primer15?Primer2Cycle2Cycle15?5?5?5?5?5?TemplateDNA5?5?5?5?5?5?5?5?基本工作原理RT-PCR第二章基因工程制药-1Cycle35?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。RT-PCR第二章基因工程制药-1RT-PCR第二章基因工程制药-1较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。化学合成法第二章基因工程制药-1方法：合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。化学合成法第二章基因工程制药-1各代表什么氨基酸？化学合成法第二章基因工程制药-1人工化学合成基因的限制：a.不能合成太长的基因。最长50-60bp.只适用于克隆小分子肽的基因。b.人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大困难，如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完全一致，易造成中性突变。c.费用太高。化学合成法第二章基因工程制药-1小结基因工程制药概述基因工程药物生产过程目的基因的获得第二章基因工程制药-1思考题1.基因工程技术的概念2.为什么将基因工程技术引入制药领域？3.应用基因工程技术生产药物有何优点？4.基因工程药物制造的基本过程。5.目的基因的获得有哪些方法？6.能否直接分离克隆真核基因用于基因药物生产？第二章基因工程制药-1BiotechnologicalPharmaceuticsBiotechnologicalPharmaceutics第二章基因工程制药-1BiotechnologicalPharmaceutics第二章基因工程制药-1BiotechnologicalPharmaceutics第二章基因工程制药-1BiotechnologicalPharmaceutics第二章基因工