菌菇制品中香菇成分定性检测方法 实时荧光PCR法.docx

1

SN/T5601—2024

菌菇制品中香菇成分定性检测方法实时荧光PCR法

1范围

本文件描述了香菇粉中含有木质素的掺杂物质显微镜检测方法和菌菇制品中香菇成分的荧光PCR定性检测方法。

本文件适用于香菇粉中含有木质素的掺杂物显微镜检测，适用于菌菇制品中香菇成分的定性检测。本方法所规定检测含有木质素掺杂物方法的检出限(LOD)为10%(质量百分比),香菇成分定性检测方法的检出限(LOD)为0.1%(质量百分比)。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

香菇成分shiitakemushroomingredient

菌菇制品中来源于香菇(Lentinusedodes)子实体、菌丝体的部分。3.2

Ct值cyclethresholdvalue

每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。

3.3

阳性对照样品positivecontrolsample

经过形态学或者分子生物学鉴定的香菇子实体组织。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。bp:碱基对(basepair)

CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide)

DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)

dATP:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate)

dCTP:脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidinetriphosphate)

2

SN/T5601—2024

dGTP:脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosinetriphosphate)dUTP:脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridinetriphosphate)

EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)Hyd1:香菇细胞核基因(hydrophobin1)

PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)

Tris:三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]

5方法提要

香菇粉中常见的掺杂物麦麸粉、木屑粉、棉籽壳粉含有木质素。木质素可以被间苯三酚染成红色，而香菇中无木质素，纯香菇粉不被染色。利用该特征，对样品进行间苯三酚处理，在显微镜下观察是否存在被间苯三酚染成深色不透明的组分，判断样品中是否存在含有木质素的掺杂物。

提取菌菇制品的DNA,以香菇的DNA为阳性对照，以其他物种的DNA为阴性对照，以无菌水作为空白对照，使用香菇特异性引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的扩增信号，判断样品中是否含有香菇成分。

6试剂和材料

除另有规定外，试验用水应符合GB/T6682中一级水的规格，所有试剂均为分析纯或生化试剂。

6.1盐酸溶液：12mol/L。

6.2间苯三酚试液：5%(质量分数)间苯三酚的95%乙醇溶液，棕色瓶避光保存。

6.3二氯甲烷。

6.4异丙醇。

6.5乙醇：95%浓度。

6.6NaCl溶液：1.2mol/L。

6.7蛋白酶K:20mg/mL。

6.8CTAB提取缓冲液：20g/LCTAB、1.4mol/LNaCl、0.1mol/LTris-HCl、0.02mol/LNa?EDTA,pH8.0。

6.9CTAB沉淀液：5g/LCTAB、40mmol/LNaCl。

6.10实时荧光PCR预混液：TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液、MgCl?、dNTPs(含dATP、dUTP、dCTP、dGTP))和UNG酶按比例配制的溶液。

6.11引物和探针：根据表1的序列合成引物和探针，加超纯水配制成100μmol/L储备液，引物和探针工作液浓度为10μmol/L。香菇hyd1引物扩增的目标序列见附录A。

表1香菇成分实时荧光