饲料中反刍动物、禽及鱼源性成分液相芯片检测方法.docx

饲料中反刍动物、禽及鱼源性成分液相芯片检测方法

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SN/T5670—2024

MES:2-(N-吗啡基)乙磺酸[2-(N-Morpholino)cthanesulfonicacid]

MFI:荧光强度中位值(Medianfluoresenceintensity)

PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamidegelclectrophorcsis)PCR:聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction)

rRNA:核糖体核糖核酸(Ribosomalribonucleicacid)SAPE:链霉亲和素枣红蛋白(Streptavidin-phycoerythrin)

SDS,十二烷基硫酸钠(Sodiumdodeeylsulfate)Tag:水生栖热菌(Thermusaquatic)

TMAC:氯化四甲基胺(Tetramethylammoniumchloride)

4技术原理

液相芯片技术以直径约6pm的微球为基质进行检测分析。微球悬浮于液相体系中，构成液相芯片检测系统，液相基因芯片检测方法通过基于微球的核酸杂交技术并联合流式细胞技术，对样品中的靶基因进行检测。每种微球都有一个独特的荧光编码号，每种编码微球表面通过偶联反应固定一种特异探针，按碱基配对原理与样品核酸的扩增产物特异结合，事先通过采用标记引物使扩增产物带有生物素基团；使杂交产物与SAPE进行反应产生报告荧光，随后利用液相芯片检测仪对微球进行荧光编码识别和荧光反应信号检测。

本文件采用液相基因芯片检测方法原理，分别以反刍动物线粒体基因组中的16SrRNA、禽线粒体基因组中的COI基因、鱼线粒体基因组中的12SrRNA保守区为靶标，采用反刍动物通用引物和探针(覆盖黄牛、水牛、牦牛、绵羊、山羊、鹿、骆驼六禽通用引物和探针(覆盖鸡、鸭、鹅、鸽、火鸡、鹤鹑、鹉鸪)和鱼通用引物和探针，进行反刍动物、禽及角共3大类动物源性成分的检测鉴定，但不区分每种大类内具体物种。采用三重液相芯片方法，可实现同步鉴别检测反刍动物、禽及鱼源性成分。

5设备与耗材

5.1液相芯片检测仪。

5.2PCR仪。

5.3台式高速冷冻离心机：离心速度不低于42000r/min.

5.4超净工作台。

5.5涡旋振荡仪。

5.6超声仪。

5.7恒温混匀仪。

5.8机械搅拌器、均质仪，或研磨装置。

5.9天平，感量0.1mg.

5.10微量核酸蛋白分析仪，或紫外分光光度计。

5.11摇床。

5.12磁力架。

5.13聚苯乙烯微孔板。

5.14可调微量移液器及带滤芯吸头：0.5μL~10pL、10μL~100μL、20μL~200pL、200μL~1000μL.

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5.15微量离心管：1.5mL。

5.16PCR反应管。

6试剂

6.1除另有规定外，所有试剂均为分析纯。试验用水符合GB/T6682中二级水的要求。

6.2微球：采用酸基化非磁性微球(MicroPlexbeads),或酸基化磁性微球(MagPlexbeads)。

6.3扩增引物和探针。各条下游引物的5端均标记生物素(biotin),HPLC纯化；各条探针的5端均C12标记氨基(AmM),HPLC纯化；上游引物采用PAGE纯化。反刍动物、禽和鱼源性成分特异扩增引物和探针序列见表1。采用无核酸酶超纯水将每条引物配制成100gmol/L储存液，置-20℃以下冻存，使用时，根据表2,取适量配制成5μmol/L或10gmol/L工作液，避免多次冻融。用无核酸酶超

纯水将每条探针配制成100μmol/L溶液，直接使用，剩余探针液置-20℃以下陈存，避免多次冻融。

表1扩增引物与探针序列

6.4热启动TaqDNA聚合酶。可采用PromegaGoTagHotStartPolymerase或其他等效产品。

6.5无核酸酶超纯水。

6.6无水乙醇。

6.7MES溶液：配制方法按附录A中A.1。

6.8TMAC溶液：1.5×TMAC配制方法按A.2,1×TMAC配制方法按A.3。

6.9EDC溶液：配制方法按A.4。

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