用于基因克隆的载体.ppt

第58页，共113页，星期日，2025年，2月5日碱裂解法：最常用用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA用无DNase的RNase去除残余的RNAcccDNAL-DNAocDNA第59页，共113页，星期日，2025年，2月5日构型：l-DNAoc-DNAccc-DNA第60页，共113页，星期日，2025年，2月5日沸水浴法：用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁沸水浴40秒钟离心，用无菌牙签挑去沉淀物乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA第61页，共113页，星期日，2025年，2月5日影响质粒DNA产量的因素（1）寄主菌株的遗传背景

一般建议使用endA基因发生突变的大肠杆菌寄主菌株，例如DH5α、JM109以及XL1-Blue等。EndA基因突变的结果，使大肠杆菌寄主细胞失去了合成具有功能活性的核酸内切酶I的能力，从而增进了所含有的质粒DNA分子的稳定性。所以从这类寄主细胞中制备的质粒DNA不仅在质量上有所改进，同时在产量上也得到了提高。（2）质粒的拷贝数及分子大小

质粒分子拷贝数的多寡和质粒分子大小是决定其DNA产量的重要因素之一。第62页，共113页，星期日，2025年，2月5日（五）质粒载体的不稳定性问题一、质粒载体不稳定性的类型分离的不稳定性：在细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配，有的细胞没有获得质粒DNΑ拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体结构的不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒DNΑ的重排与缺失。一般而言，形成无质粒细胞的频率相当低，因此在一般情况下通过随机分配质粒亦能够得到稳定的遗传。第63页，共113页，星期日，2025年，2月5日二、影响质粒载体稳定性的主要因素新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应

拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应

（五）质粒载体的稳定性问题不同细胞个体之间的质粒载体拷贝数的差异程度，简称差度低差度-稳定高差度-不稳定质粒重组的重要结果是形成质粒寡聚体，它同样是造成质粒载体不稳定性的原因之一。重组的质粒二聚体一旦形成，便会以高出质粒单体分子两倍的速度进行复制，从而导致出现质粒寡聚体的克隆增殖，

第64页，共113页，星期日，2025年，2月5日二、噬菌体或病毒DNA噬菌体：细菌的病毒，常开发为克隆载体病毒：动、植物的病毒，常开发为表达载体共同特点：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增第65页，共113页，星期日，2025年，2月5日噬菌体基本知识一．噬菌体的结构及其核酸类型根据噬菌体颗粒的结构，可归纳为三种不同的基本类型：无尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型和线状体型。大多数噬菌体，都是属于第二种结构类型噬菌体的核酸，最常见的是双链线性DNA。除此之外，还发现有双链环形DNA、单链环形DNA、单链线性DNA以及单链RNA等多种形式的噬菌体。有些噬菌体的DNA碱基并不是由标准的A、T、G、C四种碱基组成。例如，T4噬菌体DNA中就没有C碱基。

二、噬菌斑：噬菌体细胞,导致寄主细胞溶解死亡.因而在琼脂培养基表面形成的空斑.

第66页，共113页，星期日，2025年，2月5日一般溶原性噬菌体的噬菌斑中央残存着已溶原化的细胞，故成为混浊噬菌斑。相反，烈性噬菌体则形成透明噬菌斑。第67页，共113页，星期日，2025年，2月5日噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期两种不同的类型。在溶菌周期噬菌体将其感染的寄主细胞转变成为噬菌体的“制造厂”，能产生出大量的子代噬菌体颗粒。我们将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫做烈性噬菌体。

溶源生长周期，是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。具有这种溶源周期的噬菌体，叫做温和噬菌体。现已知道，只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期。

噬菌体基本知识第68页，共113页，星期日，2025年，2月5日（一）大肠杆菌的l噬菌体DNA1、l噬菌体的生物学特性：l噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体l噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成l-DNA是线性双链DNA分子，全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61个基因lDNA两端各带有