植物基因克隆的载体.pptVIP

TiPlasmidDNA区01Leftborder02Rightborder03vir区04Ori区05Con区06Ti质粒进入植物细胞的只是一小部分，约25kb。能转移到植物细胞内的DNA片断称为T-DNA（transfer-DNA）01T-DNA左右两端边界各有一个25bp长的正向重复序列(左边界，右边界)，在不同Ti质粒中高度保守。02边界序列对T-DNA转移和整合不可缺少；已证实只要保留两端边界序列，虽然中间序列不同程度被外源片断所替换，仍可转移整合到植物基因组中－Ti质粒遗传转化的理论依据。03T-DNA进入植物细胞后，能以单拷贝或多拷贝形式随机整合到染色体DNA上。且T-DNA上的基因能被植物转录系统识别，进行转录。04T-DNA区01章鱼碱合成基因（ocs）或胭脂碱合成基因（nos）或其他胭脂碱合成基因。02细胞分裂素合成基因位点Shi和控制植物生长素合成的基因位点Roi。03在两种基因表达产物的共同作用下，破坏植物内源激素的平衡，干扰植物细胞的正常分裂，引发植物产生肿瘤。在T-DNA区已鉴定出多种基因01Vir区02Ti质粒T-DNA上游的一组基因，表达产物可激活T-DNA向植物细胞转移，引发肿瘤，显示致病性。03Con区04含有与农杆菌之间接合转移有关的基因，受宿主合成的冠瘿碱激活，使Ti质粒在细菌间转移。05Ori区06调控Ti质粒的自我复制vir区基因被激活，virD基因编码的核酸内切酶分别将T-DNA的RB序列和LB序列切出单链切口，释放出T-DNA的单链线性拷贝，T-DNA复合体的产生根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着根癌农杆菌Ti质粒上的vir基因以及染色体上操纵子的活化根癌农杆菌对植物信号物质的感受T-DNA复合体在RB序列的引导下定向地穿过农杆菌的细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合到植物的染色体基因组中Ti质粒介导转化的过程同一复制系统的不同质粒在同一细菌中不能相容，不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存可扩增性质粒就其复制方式而言分为两类松弛型复制严谨型复制（6）不相容性可转移性1在天然条件下，大多质粒可通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内。非结合细菌可通过人工方法进行转化2四、质粒与宿主细胞的关系（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居”在宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响，宿主离开质粒照样的生存下去。（2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。（3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿主细胞的补偿（“交房租”）。（4）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或酶），使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相关的，如抗生素抗性基因。五、质粒载体的构建（一）为什么要进行质粒载体的构建？天然质粒载体具有一定的缺陷天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足基因工程中克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。方法：重组，“拼拼接接，挖肉补疮”pSC101，第一个用于基因克隆的天然质粒，分子长9.1kb。但只有一个EcoRI切点充当克隆位点，Tetr作为筛选标志。分子量大，拷贝数低010203ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicinE1）。colicinE1能杀死不含ColE1质粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位点EcoRI正好位于这个基因的内部。因此可通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicinE1的细胞…….（2）ColE1质粒——筛选标志不理想能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并有较多的拷贝。构建的质粒克隆载体DNA分子尽可能小。含有尽可能多的克隆位点。含有供选择克隆子的标记基因。根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种“元件”（小DNA片断），构建成不同用途的质粒克隆载体。0102030405（二）构建质粒克隆载体的基本策略五、质粒载体的构建质粒克隆载体的设计和构建过程的原则选择合适的出发质粒（亲本质粒）。正确获得构建质粒克隆载体的元件。组装合适的选择标记基因。选用合适的启动子。在能达到预期目的的前提下，构建质粒克隆载体的构建过程力求简单。四、常见的人工构建的质粒载体（一）pBR322系列pBR322是F.Bolivar和R.L.Rodrig