杂交瘤技术实验原理及其操作演示.pptVIP

杂交瘤技术的实验原理及其操作演示演示实验（一）一、杂交瘤技术产生的3个技术关键B淋巴细胞(Blymphocytes)：1.B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能。B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命细胞骨髓瘤细胞(myelomacells):添加标题恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活——长命细胞。添加标题经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株——没有抗体分泌物。2.细胞融合技术：脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞长命不分泌抗体分泌抗体短命分泌抗体长命K?hler和Milstein,19751984年Nobel医学奖3.杂交瘤细胞的筛选：脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞/?脾细胞骨髓瘤细胞/?骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞脾细胞筛选出不能长期存活不能长期存活HAT培养基筛选H,次黄嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA内源性途径(主要途径)谷氨酰胺or单磷酸尿苷酸二氢叶酸还原酶AHT外源性途径(旁路途径)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)胸腺嘧啶激酶(TK)(Thymidinekinase)B淋巴细胞：HGPRT+，TK+骨髓瘤细胞：HGPRT-，TK-存活死亡外源性途径(旁路途径)杂交瘤技术的操作流程动物免疫脾脏中B淋巴细胞B淋巴细胞大量增殖刺激能分泌针对于该抗原的特异性抗体在细胞融合后获得尽可能多的分泌针对于该目标抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞.目的：特定目标抗原1.动物免疫：0201常规免疫法脾内一次性免疫法短程免疫法体外免疫法常用免疫方法：“稳妥；优势克隆”皮下注射腹腔注射静脉注射免疫途径：“省时；省抗原”“省时”“操作繁琐”常规免疫法：第1次免疫：抗原+福氏完全佐剂第2次免疫：抗原+福氏不完全佐剂第3次免疫：抗原+不加佐剂第4次免疫：抗原+不加佐剂(皮下注射或静脉注射)(皮下注射)(皮下注射)(静脉注射)1、细胞融合方法：01单击此处添加小标题细胞融合及HAT筛选02单击此处添加小标题病毒介导的细胞融合PEG介导细胞融合电激融合细胞悬液的制备与融合细胞融合：50%PEG(1000~4000),pH8.0,38oC,1min脾细胞悬液的制备：最后一次免疫后第3天制备骨髓瘤细胞悬液的制备：于对数生长期制备2、HAT培养基的筛选融合后细胞混合液添加标题1HAT培养基添加标题22weekslater添加标题3HT培养基添加标题4正常培养基添加标题51weeklater添加标题6三、抗体的检测要求：简便、快速、敏感;在短时间内能检测大量样品常用方法：酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)间接免疫荧光法(Indirectimmunofluorescence,IFA)放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)双相扩散法酶联免疫吸附法(ELISA)抗原第1抗体酶第2抗体待检杂交瘤培养上清液底物有色产物酶标仪检测技术原理：四、克隆化有限稀释法软琼脂平板法显微操作法常用克隆化方法：ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。