蛋白质组学及技术介绍.ppt

关于蛋白质组学及技术介绍第1页，共30页，星期日，2025年，2月5日概念蛋白质组是在一个细胞的整个生命过程中由基因组表达的以及表达后修饰的全部蛋白质。蛋白质组学是蛋白质组概念的延伸。是蛋白质的规模化研究，从蛋白质水平和生命本质层次上研究和发现生命活动的规律和重要生理、病理现象的本质，揭示基因活动的动态表达。蛋白质水平的分析不仅为生物分子体系提供最有效的实时分析模型而且也获得了DNA和RNA水平上不易获得的信息。第2页，共30页，星期日，2025年，2月5日研究内容蛋白质的研究内容主要有两方面：1、结构蛋白质组学：主要是蛋白质表达模型的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析种类分析及数量确定;2、功能蛋白质组学：主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质功能及蛋白质间的相互作用。第3页，共30页，星期日，2025年，2月5日研究内容蛋白质组学可分为三个主要领域：1、蛋白质的微特性以供蛋白质的规模化鉴定和他们的后翻译饰；2、“差异显示”蛋白质组学供蛋白质水平与疾病在广泛范围的有力应用比较；3、应用特定的分析技术如质谱法（包括串联质谱法、生物质谱法）或酵母双杂交系统以及其他蛋白质组学研究新技术研究蛋白质-蛋白质相互作用。第4页，共30页，星期日，2025年，2月5日研究技术3蛋白质分离策略：1、多维色谱法，包括大小排阻色谱法、离子交换色谱法、反相高效色谱法、疏水性相互作用色谱法等；2、多维电泳技术，包括二维凝胶电泳法、自由流动电泳法、毛细管区带电泳法等；3、亲合法，包括免疫印迹法、亲和捕获；4、细胞器，膜的复合体分离。第5页，共30页，星期日，2025年，2月5日二维凝胶电泳法：二维凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。2-DE有较好的分辨率，SDS或单相IEF的最好分辨率仅为100个蛋白，而2-DE大约为3000个蛋白。第6页，共30页，星期日，2025年，2月5日蛋白质肽段的鉴定:1、氨基和羧基末端分析，如：Edman2、质谱法，包括肽片段的质谱和串联质谱法、第7页，共30页，星期日，2025年，2月5日质谱法：质谱（massspectrum）是化合物分子在真空条件下受电子流的轰击或强电场等其他方法的作用，电离成离子，同时发生某些化学键有规律的断裂，生成具有不同质量的带电荷的离子，这些离子按质荷比m/z（离子的质量m与其所带电荷z的比值）的大小被收集并记录程谱的方法。生物质谱技术是蛋白质组学研究中最重要的鉴定技术，其基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子之间的荷质比（M/E）的差异来分离并确定分子量。对于经过双向电泳分离的目标蛋白质用胰蛋白酶酶解（水解Lys或Arg的-C端形成的肽键）成肽段，对这些肽段用质谱进行鉴定与分析。目前常用的质谱包括两种：基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾质谱（ESI-MS）。第8页，共30页，星期日，2025年，2月5日蛋白质相互作用1、免疫共沉淀技术：该技术以抗体和抗原之间的特异性结合为基础，不仅能够确定生理条件下细胞或组织内2种目标蛋白质是否存在相互作用，还可以探究与己知相互作用的蛋白。它的基本原理是在非变性条件下裂解细胞，保留细胞内相互作用的蛋白质，将目的蛋白的抗体加入细胞裂解液中，使目的蛋白在体内的相互作用蛋白成电下来。经过洗脱，收集沉淀物并进行分离，最后对分离所获得蛋白进行鉴定。该方法所研究的蛋白均是在体内经过翻译后修饰的，并且是可分离的天然状态的相互作用蛋白复合物，能够反映正常生理条件下的蛋白质间相互作用第9页，共30页，星期日，2025年，2月5日蛋白质相互作用2、酵母双杂交系统：该系统利用真核细胞调控转录起始过程中，DNA结合结构域(bindingdomain,BD)识别DNA上的特异序列并使转录激活结构域(activationdomain,AD)启动所调节的基因的转录这一原理，将己知蛋白X和待研究蛋白Y的基因分别与编码AD和BD的序列结合，通过载体质粒转入同一酵母细胞中表达，生成两个融合蛋白。若蛋白X和Y可以相互作用，则AD和BD在空间上接近就能形成完整的有活性的转录因子，进而启动转录，表达相应的报告基因;反之，如果X和Y之间不存在相互作用，报告基因就不会表达。这样，通过报告基因的表达与否，便可确定是否发生了蛋白质的相互