出口化妆品中病原菌检测方法 微滴式数字PCR法 第5部分：洋葱伯克霍尔德氏菌.docx

进出口化妆品中病原菌检测方法微滴式数字PCR法

第5部分：洋葱伯克霍尔德氏菌

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SN/T5760.5—2024

6设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

6.1恒温培养箱：36℃±1℃。

6.2冰箱：2℃~8℃、-20℃。

6.3均质器或乳液分散机(转速1000rmin以上)。

6.4电子天平：感量0.1g。

6.5高速微量离心机(最大离心力不小于10000g)。

6.6涡旋振荡仪。

6.7加热装置：95℃-100℃。

6.8核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

6.9无菌均质袋或均质杯。

6.10生物安全柜。

6.11ddPCR扩增仪及相关配套设备。

6.12移液器及配套吸头：100μL~1000μL、20μL-200pμL、10pL-100pL、0.5μL~10μL。

6.13离心管：2mL、1.5mL和0.2mL。

6.14阳性对照：洋葱伯克霍尔德氏菌ATCC25416或等效菌株或含目的片段的DNA。

7材料和试剂

7.1仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

7.2DNA提取液：见附录A中A.1。

7.3含多粘菌素B的大豆酪蛋白卵磷脂吐温80(SLDLP)液体培养基：见附录A中A.2。

7.4细菌基因组提取试剂盒。

7.5生理盐水：见附录A中A3

7.6dAPCR反应配套试剂。

7.7洋葱伯克霍尔德氏游1号染色体特异性序列片段参见附录B,引物探针如下：Primer-F:5-cCNTiWCAAGACGTTCGGC-3

Primer-R:5-CITCCGCGGATTCGACAG-3

Probe-P:5-FAM-TCGCCGTCCGCAAGATGCAGG-BHQ1-3

8检验程序

进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德氏菌ddPCR检验程序见图1。

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图1进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德氏菌检验程序

9实验操作步骤

9.1样品前处理

待测的样品应在室温下保存，不要温育、冷藏和冷冻样品。样品的制样处理参照SN/T5075的规定执行。

9.2增菌培养

吸取10mL1:10样品稀释液接种到90mL含多粘菌素B的SCDLP增菌液中，置于36℃±1℃培养箱培养18h~24h。

9.3DNA提取

混匀增菌培养物，在其液面表层吸取1ml.于10000g-12000g离心3min,弃去上清液。必要时，用生理盐水清洗沉淀1次~2次。用1mL生理盐水混悬沉淀，于10000g~12000g离心3min,弃去上清液。在沉淀中加人50μLDNA提取液振荡混匀，于95℃~100℃加热10min,室温冷却2min后，于10000g-12000g离心5min,取上清液作为DNA模板。若不能及时分析，DNA模板可置于-20℃以下冷冻保存备用。

注：若采用商品化DNA提取试剂盒，按其操作说明制备DNA模板。

9.4DNA浓度和纯度测定

样品DNA使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定260nm和280nm处的吸收值A按照公式(1)计算DNA的浓度。

p=Am×Nx50……

和A

…(1)

表1ddPCR反应体系

试剂名称

储备液浓度

终浓度

体积HL

反应预混液

2x

10.0

Primer-F

0μmol/L

090jmal/L

1.8

Primer-R

0μmJ/L

0.90μmol/L

1.8

Pnde-P

0μJL

0.45μmel/L

0.9

DNA模板

一

2.0

水

一

3.5

体系总体积

一

20.0

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附录A

(规范性)

主要培养基和试剂

A.1DNA提取液

A.1.1成分

Chelex-100

灭菌一级水

5.0g

100mL

A.1.2制法

将Chelex-100顺粒加入灭菌一级水中混匀，2℃~8℃保存。

A.2含多粘菌素B的大豆酪蛋白卵磷脂吐温80(SCDLP)液体培养基

A.2.1成分

酪蛋白胨

大豆蛋白胨氯化钠

磷酸氢二钾

葡萄糖卵磷脂吐温80蒸馏水

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