出口化妆品中病原菌检测方法 微滴式数字PCR法 第4部分：肺炎克雷伯氏菌.docx

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SN/T5760.4-2024

进出口化妆品中病原菌检测方法微滴式数字PCR法

第4部分：肺炎克雷伯氏菌

1范围

本文件描述了进出口化妆品中肺炎克雷伯氏菌的微滴式数字PCR检测方法。本文件适用于进出口化妆品中肺炎克雷伯氏菌的快速检测。

本文件所能达到的检出限(LOD?)为0.27CFU/g(mL)-0.47CFU/g(mL)。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件，不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

SN/T2206.3化妆品微生物检验方法第3部分：肺炎克雷伯氏菌SN/T5075化妆品微生物检验制样规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

DNA:脱氧核糖核酸(DeoyribonuleicAcid)

ddPCR:微滴式数字PCR(dropletdigitalPolymenseChainReaction)

PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)

5方法原理

针对肺炎克雷伯氏菌phoE基因设计引物、探针，将一定浓度的引物、探针与模板DNA及反应预混液混合，配成PCR反应体系。将该数字PCR体系分布到12000个~20000个微滴中，使大部分微滴中模板DNA分子的数量为1或0,然后进行PCR扩增。探针5端标记FAM荧光基团，3端标记BHQ1。利用数字PCR系统的检测通道，可对每个微滴的荧光信号进行采集分析。含有模板DNA的微滴出现荧光信号的增强，形成阳性微滴簇。最终根据阳性微滴的有无判定样品中是否含有肺炎克

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SN/T5760.4—2024雷伯氏菌。

6设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

6.1恒温培养箱：36℃±1℃。

6.2冰箱：2℃-8℃、-20℃。

6.3均质器或乳液分散机(转速1000rmin以上)。

6.4电子天平：感量0.1g。

6.5高速微量离心机(最大离心力不小于10000g)。

6.6涡旋振荡仪。

6.7加热装置：95℃-100℃。

6.8核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

6.9无菌均质袋或均质杯。

6.10生物安全柜。

6.11ddPCR扩增仪及相关配套设备。

6.12移液器及配套吸头：100μL~1000pL、20pL~200μL、10μL-100pL{5以~10μL。

6.13离心管：2mL、1.5mL和0.2mL。

6.14阳性对照：肺炎克雷伯氏菌CICC21519或等效菌株或含目的片段的DNA。

7材料和试剂

7.1仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

7.2DNA提取液：见附录A中A.1。

7.3大豆酪蛋白卵磷脂吐温80(SCDEP液体培养基：见附录A中A.2。

7.4细菌基因组提取试剂盒。

7.5生理盐水：见附录A中A3

7.6ddPCR反应配套试

7.7肺炎克雷伯氏菌phoE基因特异性序列片段参见附录B,引物探针如下：Primer-F:5-CTGGCGACCATGTACTCTG-3

Primer-R:5-CCACCGCTTCAAACTTCTG-3

Pmobe-P:5-FAM-AAACCCGCAAGATGACCCCGAT-BHQ1-3

8检验程序

进出口化妆品中肺炎克雷伯氏菌dAPCR检验程序见图1。

SN/T5760.4—2024

样品制备

样品制备

取01:10样品稀样液加入种.SDP地阳液C±I℃,181h-24

细提取

PC8检测

阳性阳性

SVT206.8确认

报告

图1进出口化妆品中肺炎克雷伯氏菌检验程序

9实验操作步骤

9.1样品前处理

待测的样品应在室温下保存，不要温育、冷藏和冷冻样品。样品的制样处理参照SN/T5075的规定执行。

9.2增菌培养

吸取10mL1:10样品稀释液接种到90mLS