《载体构建流程》课件.ppt

载体构建流程

什么是载体构建

载体

载体是一种可以将外源基因导入受体细胞的工具，通常是环状的DNA分子。

载体构建

载体构建是指将目标基因插入到合适的载体中，并构建成可以表达或复制的重组DNA分子。

载体构建的意义

将外源基因导入宿主细胞，实现基因表达、蛋白生产或功能研究。

构建新的基因表达系统，用于生物技术和医药领域。

开展基因功能研究、药物筛选、基因治疗等。

载体构建的流程

1

载体选择

2

载体修饰

3

载体包装

4

载体表征

5

载体纯化

载体选择

1

实验目的

根据实验目的选择合适的载体。例如，如果需要表达目的基因，就需要选择表达载体；如果需要克隆目的基因，就需要选择克隆载体。

2

宿主细胞

选择与宿主细胞相容的载体。例如，大肠杆菌常用的载体有pUC系列，pBR系列，pET系列等。

3

载体类型

选择合适的载体类型，例如克隆载体，表达载体，病毒载体，质粒载体等。

4

载体大小

选择合适的载体大小，例如，用于克隆较大基因片段的载体应该选择较大容量的载体。

载体修饰

酶切

使用限制性内切酶切割载体和目的基因，使它们能够连接。

连接

使用连接酶将切割后的载体和目的基因连接在一起，形成重组载体。

验证

通过酶切鉴定和测序验证重组载体是否成功构建。

载体包装

目的基因插入

将目的基因准确地插入载体，确保基因表达和功能完整。

载体扩增

构建好的载体，需进行扩增以获得足够的量进行后续实验。

载体纯化

通过纯化去除杂质，确保载体的高纯度和活性。

载体表征

酶切鉴定

通过限制性内切酶消化和电泳分析，验证载体结构的完整性。

测序验证

对载体进行测序，确保插入片段的正确方向和序列。

功能验证

根据载体的功能，进行相应的实验，例如表达蛋白的检测或基因的功能分析。

载体纯化

去除杂质和污染物

提高载体纯度

确保载体活性

载体溶液备制

精确配制

根据载体类型和实验需求，精确配制载体溶液。

溶液保存

选择合适的容器和条件保存载体溶液，以确保其稳定性。

严格操作

严格按照操作规范，避免污染和误差。

质粒编码

目标基因

根据实验目的，选择合适的基因序列，并进行相应的修饰，以确保其能够在目标细胞中正确表达。

载体序列

将目标基因插入到合适的载体中，确保基因表达所需的调控元件和标记基因等都包含在载体序列中。

合成质粒

利用合成基因技术，将目标基因和载体序列合成在一起，形成完整的质粒编码序列。

质粒转化

1

制备感受态细胞

将细菌细胞处理，使其处于可以接受外源DNA的状态。

2

质粒DNA加入

将构建好的质粒DNA加入到感受态细胞中。

3

热激处理

将感受态细胞置于特定温度下，促进质粒DNA进入细菌细胞。

4

恢复培养

将处理后的细菌细胞在合适的培养基中恢复生长。

阳性克隆筛选

1

菌落形态观察

通过肉眼或显微镜观察，辨别目标克隆菌落的大小、颜色和形状。

2

抗性验证

将目标克隆菌落划线接种到含有抗生素的培养基上，验证其是否具有抗生素抗性。

3

PCR鉴定

利用PCR技术对目标克隆菌落进行扩增，并通过电泳检测目的基因片段的大小和完整性。

4

测序验证

对目标克隆菌落进行测序，验证插入基因片段的序列是否正确。

质粒扩增

目的

扩增目标质粒，获得大量目标质粒DNA，以备后续实验使用。

方法

采用细菌转化和培养，利用细菌的复制机制扩增质粒DNA。

步骤

将目标质粒转化到感受态细菌，并在培养基中培养细菌，直至细菌大量繁殖，质粒DNA随之复制增殖。

注意事项

选择合适的细菌菌株，优化培养条件，避免质粒DNA丢失或降解。

质粒提取

从细菌细胞中分离出质粒DNA

去除细胞碎片和其它杂质

获得纯净的质粒DNA

质粒修饰

添加新的基因片段

通过基因工程技术，将目的基因插入载体中，以实现特定功能。

改变现有基因片段

对载体上的基因进行突变、删除或替换，以改变其表达特性。

添加新的调控元件

插入启动子、终止子等元件，控制基因的表达水平和时序。

质粒浓缩

目的

提高质粒浓度，节省后续实验步骤。

方法

使用浓缩试剂盒或离心过滤装置，去除水分子，提高质粒浓度。

注意事项

选择合适的浓缩方法，避免质粒降解或损失。

质粒纯化

试剂盒法

使用市售的质粒纯化试剂盒，可以快速高效地分离纯化质粒DNA。

离心法

利用超速离心技术，可以将质粒DNA与其他细胞成分分离，获得纯化的质粒DNA。

质粒测序

确认序列

验证构建的质粒序列是否正确，确保目标基因插入位置和方向。

检测突变

识别可能发生的突变，确保插入基因的完整性和准确性。

提供数据

为后续实验提供准确的序列信息，用于分析和研究。

质粒质量检测

质粒保存

1

正确保存

选择合适的保存方法，例如-20°C或-80°C冷冻保存，以确保质粒的稳定性。

2

避免反复冻融

反复冻融会导致质粒降解，因此建议一次性分装成小份，避免频繁操作