第五章 固相析出分离法课件.ppt

*柠檬酸从热水中结晶时，生成无水合物；在冷水中结晶则生成一水合物。*柠檬酸从热水中结晶时，生成无水合物；在冷水中结晶则生成一水合物。柠檬酸是一种较强的有机酸，有３个Ｈ＋可以电离；其钙盐在冷水中比热水中易溶解，此性质常用来鉴定和分离柠檬酸。在柠檬酸发酵液中，除了主要产物外，还含有其他代谢产物和一些杂质，如草酸、葡萄糖酸、蛋白质、胶体物质等，成分十分复杂，必须通过物理和化学方法将柠檬酸提取出来。大多数工厂仍是采用碳酸钙中和及硫酸酸解的工艺提取柠檬酸。*冷乙酸：酸性条件下提取用硫酸调pH原因硫酸铵：盐析氯化钙作用：激活的原理*黄血盐作用硫酸锌作用pH1.7-1.8原因滤液成分*浓氨水作用温度原因pH作用：等电点沉淀成分第五章固相析出分离法例3：胰蛋白酶的提取从动物胰脏中提取胰蛋白酶工艺胰蛋白酶原的溶解：酸性条件下稳定溶解液中含有大量的酸性杂蛋白（pI10.8)浓缩分离胰蛋白酶原（盐析）溶解激活（酶原-酶）胰蛋白酶的进一步分离：酶溶液中糜蛋白弹性蛋白等与胰蛋白酶在不同的盐浓度下溶解度不同第五章固相析出分离法胰蛋白酶的提取（二）胰蛋白酶原激活滤饼溶解,加入无水CaCl2,边加边搅拌,最终含有0.1MCaCl2；5MNaOH调pH至8.0,加极少量胰酶搅拌，于室温下活化8～10小时；活化完成，用2.5MH2SO4调pH至2.5-3.0，抽滤除去CaSO4沉淀。（一）猪胰蛋白酶原的提取胰脏绞碎加入2倍体积冷乙酸(pH2.5)低温搅拌24小时，过滤；滤液用2.5MH2SO4调pH至2.5～3.0，放置3～4小时后，用滤纸过滤；滤液加入硫酸铵,达0.75饱和度放置过夜抽滤，得酶原粗制品。（三）胰蛋白酶的分离将激活溶液加入固体硫酸铵,达0.4饱和度,数小时后抽滤弃滤饼。滤液加入硫酸铵，饱度达到0.75，放置数小时，抽滤弃滤液，即得胰蛋白酶粗品。第五章固相析出分离法例4：四环素的沉淀提取四环素由链霉菌发酵获得四环素等电点pI=5。当溶液的pH等于等电点时，四环素易从水溶液中沉淀出来（游离碱），因此可用于四环素的提取。四环素又能与尿素形成1：1的复盐，从水溶液中沉淀出来，该复盐溶于有机溶剂时，即分解成四环素和尿素。四环素与尿素的这一反应具有特异性：金霉素，土霉素都不能与尿素形成复合物沉淀。利用这一性质，可精制四环素。第五章固相析出分离法四环素发酵液预处理加草酸酸化至PH1.7-1.8，分别加0.2％(w/v)黄血盐、硫酸锌过滤滤洗液发酵液滤渣0.5%草酸水顶洗洗液滤液第五章固相析出分离法第一步沉淀提取沉淀粗碱滤液7000-9000u/ml搅拌下慢慢加入浓氨水调pH4.810-15℃，搅拌30min，过滤第五章固相析出分离法第二步沉淀提取溶于尿素盐酸溶液中（粗碱干重:尿素:水:浓HCl1:2:2:0.25）粗碱粗碱尿素溶液沉淀四环素尿素复盐丁醇清液丁醇悬浮溶液溶于酸性丁醇中复盐干重:丁醇:浓HCl＝1:10:0.3(丁醇先，搅拌下滴加HCl)滤去不溶物浓氨水调pH4.6～4.8搅拌20min，过滤结晶第五章固相析出分离法思考题1.沉淀与结晶有何不同？常用的沉淀方法包括哪些？2.何谓盐析？其原理是什么？常用的盐析方法有哪些？影响盐析的主要因素有哪些？盐析操作时常用的盐是什么？3.有机溶剂沉淀法的主要原理是什么？影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？4.什么是结晶？结晶过程包括哪些？在何种条件下，溶液中才有晶体析出？5.提高晶体质量的途径*生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。固相析出基本原理就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。**成本低，不需要特别昂贵的设备。操作简单、安全。不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质。分离效果不理想，通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化方法。*?为纵坐标上的截距，是外推截距，与无机盐种类无关。KS是盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关，但与温度和pH无关。*盐析能力*一般多价阴离子的盐析作用强，盐溶解度受温度影响小*溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，由于酶和