猪伪狂犬病的PCR诊断.pptVIP

实验七猪伪狂犬病PCR诊断实验目的：了解PCR反应的原理、方法及操作步骤；01掌握猪伪狂犬病毒PCR检测的方法；02讲述PCR反应的原理、方法及操作步骤，03猪伪狂犬病毒PCR检测。04实验内容：什么是PCR？聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。PCR反应的原理、方法及操作步骤PCR原理PCR是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。高温变性，低温退火，适温延伸等３步反应循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。PCR原理PCR技术在模板DNA、dNTP、Mg2+、合适Buffer等条件下，用耐热的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3个步骤的反复循环（25?30次）过程，使目的DNA呈指数扩增。反应程序变性：93-94℃2min变性：93-94℃30s复性：55-65℃30s延伸：72℃30s延伸：72℃2min35个循环PCR原理SampledenaturatationPrimerannealingPrimerextensionPCRproduct标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液10ul添加标题4种dNTP混合物各200umol/L添加标题引物10～100pmol添加标题模板DNA0.1～2ug添加标题TaqDNA聚合酶2.5u添加标题Mg2+1.5mmol/L添加标题加双或三蒸水至100ul添加标题酶及其浓度目前有两种TaqDNA聚合酶供应天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成一个典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时）浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少引物引物是PCR特异性反应的关键PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增引物在线设计网址：primer/primer3_www.cgiPCR产物分析凝胶电泳分析法可用琼脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小。同时应以标准DNA分子量作平行对照，凝胶中加入溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。