基因探针课件.ppt

多克隆位点SP6启动子T7启动子将靶序列克隆于带有噬菌体启动子的质粒中，这些启动子可被噬菌体编码的依赖于DNA的RNA聚合酶所识别用切点位于靶序列远端的限制酶消化重组质粒产生平端或3’凹端SP6启动子T7启动子SP6噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶3种未标记rNTP1种32p标记rNTP用DNA酶I消化以去除模板DNA32p标记的RNA体外转录合成RNA探针(从左到右)基因探针DNA的5’或3’末端标记不同的末端标记用不同的酶：1）大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段：3’末端标记2）T4噬菌体多核苷酸激酶：标记DNA5’端3）T4噬菌体DNA聚合酶：标记DNA3’端基因探针寡核苷酸标记①T4噬菌体多核苷酸激酶：合成的寡核苷酸在合成时其5’端缺少一个磷酸基，因而极易用T4噬菌体多核苷酸激酶进行磷酸化反应，从而将γ-32p从[γ-32p]ATP转移至其5’端。②大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段：用大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段合成与合成寡核苷酸互补的DNA链，可得到高比活度的探针。用一短引物与寡核苷酸模板结合，后者的序列互补于所用的放射性标记探针。该引物随后在大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段的作用下延伸，从而使[α-32p]dNTP在模板指导下发生掺入。基因探针标记基因探针的纯化1）乙醇沉淀法2）CPB沉淀法：回收用磷酸盐缓冲液从羟基磷石灰层析柱洗脱下来的DNA3）放射性标记探针的纯化:19%PAGE电泳、Bio-GelP-60柱或Sep-Pak柱层析基因探针1）探针浓度①同位素标记的探针：5-100ug/mL②非同位素标记的探针：25-1000ug/mL③原位杂交：0.5-5.0ug/mL注：2）随机多聚体①硫酸葡聚糖：5-10%②PEG6000-8000③聚丙稀酸（钠盐）：2-4%基因探针转印虹吸印迹法电转移法DNA片段大小影响转移速度.基因探针预杂交用DNA酶I消化并变性的小牛胸腺DNA或鲑精DNA封闭膜.基因探针杂交液5XSSC20mmol/L鳞酸缓冲液(pH7.0)5XDenholdt氏液10%硫酸葡聚糖100μg/ml变性小牛胸腺DNA或鲑精DNA.50%甲酰胺基因探针洗涤液2XSSC,0.5%SDS5min.2XSSC,0.1%XSDS15min.(室温).0.1XSSC,0.1%XSDS37°C30min至1h.0.1XSSC,0.1%XSDS65°C洗涤30min至1h.(水浴)显影(放射性,非放射性)基因探针原位杂交原位杂交1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。基因探针原位杂交技术的基本方法：(一),杂交前探针种类选择。(二),杂交前探针标记方法选择。(三),探针的纯化。(四),杂交前准备,包括固定、取材、玻片和组织的处理，增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等。(五),组织的前处理。(六),预杂交。(七),原位杂交。(八),杂交后处理(漂洗)。(九),杂交后显色。基因探针原位杂交固定目的是为了保持细胞形态结构，最大限度地保存细胞内的DNA或RNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。RNA更易被酶降解，应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对RNA保存所带来的影响，因组织中mRNA的降解是很快的。基因探针固定剂最常用多聚甲醛固定组织。醋酸酒精的混合液和Bouin′s固定剂也能获得较满意的效果。mRNA的定位将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1~2h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10min，空气干燥后保存在-70℃。如冰箱温度恒定，在-70℃切片可保存数月之久不会影响杂交结果。基因探针在病理学活检取材时多用福尔马林固定和石蜡包埋。其它固定剂如应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片也可获满意效果。各种固定剂均有各自的优缺点，如沉淀性(Precipitating)固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液等能为增加核酸探针的穿透性提供最佳条件,但它们不能最大限度地保存RNA,而且对组织结构有损伤。戊二