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ATP13A2调控SH-SY5Y细胞铁死亡的作用及机制研究

摘要

目的：帕金森病（Parkinson′sDisease，PD）是第二常见的神经退行性疾病。PARK9

（也称为ATP13A2）是目前已经鉴定的PD致病基因之一，该基因与一系列神经退

行性疾病有关，包括Kufor-Rakeb综合征（KRS，一种青少年发病的PD）。ATP13A2

编码的ATP13A2蛋白是一种晚期内溶酶体转运蛋白，其在阳离子跨内体或溶酶体

膜的主动转运中起重要作用。研究发现PD患者黑质（substantianigra，SN）的多巴

胺能神经元中ATP13A2水平降低，且也有研究报道当ATP13A2缺乏时可导致溶

酶体和线粒体功能障碍及细胞内铁代谢的失调，从而参与多巴胺能神经退变，而

ATP13A2突变所导致的线粒体的功能缺陷可以被铁螯合剂和线粒体自噬诱导剂所

挽救。PD患者进行性多巴胺能神经元丧失的特征性病理与铁积累和铁死亡有关。铁

死亡是一种受调节的铁依赖性细胞死亡途径，涉及脂质过氧化物的积累，且在病理

生理学上与PD的发病机制有共同特征。然而，ATP13A2是否及如何调控铁死亡仍

不清楚。

方法：本研究在体外培养的神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞中，通过枸橼酸铁

胺（ferricammoniumcitrate，FAC）建立高铁细胞模型，给予铁死亡诱导剂

RSL3/Erastin诱导细胞铁死亡。运用免疫印迹法检测溶酶体相关蛋白即组织蛋白酶

B（cathepsinB，CTSB）、组织蛋白酶D（cathepsinD，CTSD）、葡萄糖脑苷脂酶

（glucocerebrosidase，GCase）、溶酶体整合膜蛋白2（lysosomeintegratedmembrane

protein2，LIMP-2）、ATP13A2的表达变化。检测FAC或铁死亡诱导剂RSL3/Erastin

或二者联合处理后检测ATP13A2的表达变化。分别建立过表达（overexpression，

OE）或敲低（knock-down，KD）ATP13A2的SH-SY5Y细胞，检测铁死亡标志蛋

白谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathioneperoxidase4，GPX4）、铁代谢相关蛋白转铁蛋

白受体1（transferrinReceptor1，TFR1）、重链铁蛋白（ferritinheavychain，FTH）

变化，运用酶联免疫吸附实验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA）检测

细胞外基质及细胞内α-突触核蛋白（alpha-synuclein，α-Syn）水平，流式细胞仪检

测活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）及线粒体膜电位（mitochondrialmembrane

potential，MMP）水平，CCK8检测细胞存活率的变化。ATP试剂盒检测细胞内三

磷酸腺苷（adenosine-triphosphatetriphosphate，ATP）水平的变化。转录组测序技术

检测过表达ATP13A2和RSL3处理后细胞的差异表达基因。

结果：

1.100μmol/L和1mmol/LFAC分别处理SH-SY5Y细胞24h后会诱导FTH升

高，提示细胞内铁过载。1mmol/LFAC处理细胞后，溶酶体相关蛋白LIMP-2、GCase

和CTSB蛋白表达水平升高，而CTSD蛋白表达水平不变。结果提示，细胞内铁

过载时溶酶体功能出现损伤。

2.1mmol/LFAC处理SH-SY5Y细胞24h后GPX4蛋白表达水平下降，提示细

胞发生一定程度的铁死亡，但而不影响ATP13A2蛋白表达水平。2μmol/L铁死亡

诱导剂RSL3处理细胞24h后，ATP13A2和GPX4蛋白表达水平仅有下降趋势

而没有统计学意义，而5μmol/L和10μmol/LRSL3处理后两种蛋白水平都下降。

当1mmol/LFAC联合0.5