植物细胞培养及原生质体培养.pptVIP

细胞悬浮培养的诱导：将离心管中近l／3的悬浮细胞1培养物倒入三角瓶中，并根据所需要的起始密度补加新鲜培养基，悬浮细胞在120转／分，25℃黑暗下培养。并定期计数细胞密度，计录并绘制细胞生长曲线．2细胞团和愈伤组织的再形成及植核再生3大约在悬浮培养2周后，将细胞分裂形成的小愈伤组织团块(直径约1．5—2．5mm)及时转移到分化培养基上(Ms基本成分，附加0．3％酵母提取物，0．3％水解酪蛋白，10mg／LKT．0．4mg／LNAA及7．0％蔗糖)。连续光照，空温25℃。3周后即可分化出试管苗。如果不及时转移，愈伤组织团块很快失去分化能力，转入分化培养基后即停止生长，变褐，死亡。4三七细胞培养工艺：工艺流程：培养基植物愈伤组织诱导及培养所用培养基为Ms培养基，烟酸0.5mg/l，肌醇100mg/l，甘氨酸2.0mg/l及蔗糖30g/l，pH5．6—pH5．8。三七种质材料选择与处理取3—4年生三七植株粗根，用自来水充分洗净．再用70％乙醇冲洗表面后切成小块，在70％乙醇中浸泡2min再转移至0．1％升汞溶液中浸泡20min然后用无菌水冲洗4—5次，备用。愈伤组织诱导与培养：将上述无菌三七粗根小块组织接种于含2mg/l的2，4—D、0.5mg/lKT及10％椰子乳的MS固体培养基中，于25℃的培养箱中培养40天，即可形成小的愈伤组织块，然后每隔30天进行一次继代培养。每次继代培养均取一块愈伤组织，如此多次继代培养即可获得多个愈伤组织无性系。2.工艺过程：（4）．细胞悬浮培养:培养基为含lmg/l2,4-D、0.05mg/lKT及l0％椰乳的MS培养基pH5.8。l00ml三角瓶的培养基装量为25ml，高压灭菌20min冷却后按1-2g/L干重接种愈伤组织．愈伤组织切成干重1mg小块。于25℃摇床中以120转／分钟振荡培养30天，即得三七悬浮细胞培养物。（5）三七细胞大量培养：培养基与悬浮细胞培养相同。在l0L搅拌反应器中加入培养液，培养液充满系数为0.75一0.80，灭菌后冷却至室温．接种已培养25—30天的悬浮培养细胞，接种量按干细胞计为1—2g/L，在25—26℃下，以60转／分钟搅拌速度及0．6vvm—o．8vvm(vvm为每分钟单位体积培养液中通入空气的体积数)速度通气，并维持pH5.5—5.8．培养30天，收获细胞。（6）细胞收集及干燥：每批细胞培养30天后，离心或过滤收集细胞，用去离子水洗涤3次，每次抽干，然后于30一40℃低温下真空干燥或冻干，即得三七培养细胞成品。原生质体培养技术：通过一定方法除去细胞壁，而得到一个裸露的植物细胞，即为原生质体(Protoplast)。游离的原生质体在一定条件下培养可以重新形成细胞壁，并像正常的植物细胞那样具有全能性，经过适当的培养可以再生出完整植株。A-D当归(Angelicasinensis(Oliv)Diels)原生质体培养成再生苗E-H,红豆草(OnobrychisvicaefoliaScop))原生质体培养再生植株利用原生质体不具细胞壁的特性可以进行细胞器移植和外源物的摄取(病毒、微生物、外源遗传物质)，原生质体之间可以进行融合而产生杂种细胞(即体细胞杂交）。是植物基因工程的理想受体，用外源遗传物质对植物原生质体进行改造和转化，然后诱导分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。也是研究细胞生物学、分子生物学、体细胞无性系变异和植物病理学研究的有用工具。原生质体培养的目的：STEP2STEP1自1970年首次获得原生质体再生植株成功以来，通过原生质体获得再生植株的植物约有280余种，其中有20种为我国首先报道。原生质体培养包括原生质体的分离、培养、植株再生等过程。01材料来源与预处理：(一)原生质体的制备：02可以用各种组织和器官，但多应用叶片、愈伤组织及悬浮培养细胞。以及茎尖、根尖、子叶和胚性组织。（1）材料来源：预质壁分离：17-20℃酶液中静置半小时，再于28—34℃保温，或将材料置于与酶液中糖浓度相同的溶液中预培养1h左右，再浸于酶液中消化即可达到质壁分离目的；暗处理:将室温下生长5—7个星期的植物材料在黑暗中放置30h以上，取其叶片制备的原生质体有活力；低温处理:夏季应用的实验材料其萌动种子应于4℃过夜后再播种，从其植株叶片上分离的原生质体培养效果较佳。（2）预处理：预培养:将除去下表皮的叶片于诱导愈伤组织培养基上培养7天，再用酶消化去壁，所得原生质体分裂频率较高；光处理:将叶片于日光或灯光下照射2—6h令其萎蔫，利于撕除下表皮及原生质体分离；制备原生质体的酶类：高等植物细胞壁主要成分为a-纤维素，其次为半