植物细胞工程课件第三章细胞克隆与种子细胞筛选.pptVIP

将解离获得的细胞沉淀用培养液配制成需要的细胞悬液接种到培养瓶内水平放置，37℃下静止培养每隔1-2天换培养液一次培养一定时间后，细胞在培养瓶底即形成一单细胞层。01单层细胞培养02更换培养基容易01便于观察不同条件对细胞生长的影响02培养后期容易使用灌注技术改善营养条件03细胞贴附于基底质上，更容易表达产物04单层细胞培养可适用于许多动物细胞的原代培养。05特点适用细胞具有非贴壁特性的细胞，如血细胞、腹水细胞等，或者通过机械搅拌和振荡能够较好地维持悬浮状态的细胞。01悬浮细胞培养02在相应的培养容器内接种一定密度的细胞悬液。接种密度与细胞倍增时间有关，倍增时间在24-48h的细胞类型接种密度以105/ml细胞为宜，倍增时间在12-18h的细胞类型接种密度以2×104/ml为宜。单个培养瓶的接种体积以厚度不超过2cm为好。01基本方法与植物细胞的悬浮培养相似023.3.2继代培养subculture单层细胞培养贴壁细胞再培养悬浮培养非贴壁细胞培养01震荡法在培养瓶中加入平衡盐溶液，轻轻震动培养瓶，可以使贴壁疏松的细胞进入到溶液内，然后收集洗涤用于培养。02蛋白酶消化用PBS配制0.01-0.5%的胰蛋白酶消化液，37℃处理5-15min.，然后洗涤用于培养。从原代培养物中解离细胞：EDTA溶液洗涤用PBS配制1mmoll-1dEDTA，弃去原代培养的培养液，转入EDTA洗涤细胞，然后再用0.25%的胰蛋白酶消化，次法用于贴壁性极强的细胞获取。机械剥离用细胞刮、细胞铲或其它工具直接剥离原代培养物。动物细胞的培养步骤

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切取拟培养的动物器官或大组织块

洗去血污

剔除多余成分

切成约1mm3大小的组织块将所有组织剪碎

用于组织培养蛋白酶溶液消化

机械方法吹打组织块

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离心、培养液悬浮

计数、调节细胞密度

用于分离细胞培养?准备工作例1乳鼠肾细胞原代培养培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。点燃酒精灯，用品按布局放置，安装吸管等。采用颈椎脱臼法，将一只新生乳鼠处死置超净工作台内用另一镊子轻轻夹起肠管,翻置一侧,充分暴露位于腹腔背壁脊柱打开消毒器械包用镊子掀起乳鼠腹部皮肤,用解剖剪剪开腹腔,充分暴露腹腔将小鼠放入盛有酒精的烧杯中数秒乳鼠肾细胞原代培养01.取下双侧肾脏,放入消毒培养皿中02.用吸管吸取PBS加入培养皿中,清洗肾脏3次,尽量去掉血污.03.将肾组织用解剖剪剪成几块，再用PBS漂洗，去净血液.将洗净的组织块移入消毒小瓶中,用眼科剪剪切至0.5mm大小的组织块。

加入5-8倍体积的0.25%胰蛋白酶，盖好放入37℃水浴中消化20-30分钟,注意应每隔5分钟振摇一次。

当组织块变得疏松,颜色略白时，取出置于超净工作台内.胰蛋白酶消化用吸管反复吹打组织块,使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态。01加入1-2ml培养液终止消化，净置片刻，让未消化完的组织块自然下沉,将上部的组织悬液移入无菌离心管中。02800-1000rpm离心8-10min,取上清加入适量培养液,细胞计数后分装；

在细胞瓶(板)上标明细胞名称，代数，日期；

倒置显微镜下观察细胞分散情况后置37℃孵箱中培养。离心及计数01.培养细胞每天观察，检查：A.污染与否?B.细胞生长状态。02.细胞观察如见培养液变为黄色且又混浊，为污染;如培养液为桔红色，表明细胞状况良好。在无污染时，24