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条件性敲除小鼠

定义：

条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。

CKO如何实现？

重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术。

Cre是重组酶（38kDa），可识别34bp长的DNA序列loxP。loxP两侧各13bp构成回文结构，中间8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性。

当DNA分子上同时存在两个同向的loxP序列时，Cre蛋白能够将这两个loxP序列之间的DNA片段切割下来，并使其形成环状结构。此外，它还能够在loxP序列的两侧进行连接操作。

另一方面，当DNA分子上同时存在两个方向相反的loxP序列时，Cre蛋白可以引发loxP序列之间的DNA发生反转。

CKO敲除的是什么？

条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre重组酶识别的loxP序列，这种基因称为floxedgene。

带有floxed靶基因的小鼠称为flox小鼠。在这种小鼠中，通常采用DNA同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP位点。

loxP位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠

CKO敲除何时何地发生？

除了flox小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre工具鼠。

Cre工具鼠中，将Cre重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。

Cre蛋白在特定的组织细胞中表达，其靶基因的敲除活动则发生在这些特定细胞。Cre蛋白的表达水平会直接影响到靶基因在这些特定细胞中的修饰效率。通过使用诱导型Cre重组酶，可以借助于诱导剂的作用，在特定的发育时期或疾病发生阶段，实现定时的基因敲除。

（范衡宇老师课件）

在实验中，我们通过将flox小鼠和Cre工具鼠进行交配，最终获得了纯合的flox基因和杂合的Cre基因的小鼠。这类小鼠中，那些表达Cre蛋白的细胞会被两个loxP序列之间的序列切除，从而实现组织特异性基因敲除。

（参考资料：南方模式生物官网）

交配策略

将获得的flox杂合子小鼠（geneflox/+）分成两部分：

flox/+小鼠与Cre小鼠交配，同时获得flox阳性且Cre阳性小鼠（该小鼠简写为：geneflox/+；Cre+），flox阳性且Cre阴性小鼠（geneflox/+）；

flox小鼠自交，获得flox纯合（该小鼠简写为：geneflox/flox）和flox杂合小鼠（geneflox/+）。

为获得flox纯合且Cre阳性的小鼠，可有两种繁育方法选择：

通过将flox和Cre双阳性杂合子小鼠（geneflox/+：Cre+）与flox杂合子小鼠（geneflox/+）进行交配，最终形成了flox基因纯合且Cre表达阳性的实验组小鼠（简写为：geneflox/flox；Cre+），以及flox基因纯合且Cre表达阴性的对照组小鼠（简写为：geneflox/flox）。

通过将获得的flox和Cre双阳性杂合子小鼠（geneflox/+：Cre+）与flox纯合子小鼠（geneflox/flox）进行交配，我们最终获得了flox纯合且Cre阳性的实验组小鼠（geneflox/flox；Cre+）。这些小鼠在后代中的比例为1/4。同时，我们还得到了flox纯合且Cre阴性的对照组小鼠（geneflox/flox），其后代比例也为1/4。

后续实验（实验组：geneflox/flox；Cre+，对照组：实验组：geneflox/flox）

为快速获得上述所需小鼠，可将geneflox/flox；Cre+小鼠与geneflox/flox小鼠杂交

小鼠基因型鉴定

小鼠编号原则

Flox小鼠基因型鉴定（用于鉴定flox纯合、杂合和野生型）

PCR鉴定引物位置示意图（可选择P1,P2引物对，或P3,P4，P1,P4引物对）

目的基因组织特异性敲除效果验证

DNA水平cre活性验证

通常是取一小块表达Cre的组织，抽提基因组DNA，通过PCR的方法对flox区域进行扩增，通过flox区域的有无，定性判断Cre是否发挥作用。

RNA水平cre敲除效率验证

通常是取一小块表达Cre的组织，抽提RNA，反转录成cDNA后，通过Realtime-PCR的方法，利用Cre作用后的mRNA，所设计的引物无法扩增出PCR产物的原理，定量判断Cre作用效率。

蛋白水平cre敲除效率验证

目的组织westernblot或免疫组化检测。原理：表达cre的组织无法检测到目的蛋白。

动物组织DNA抽提

250ul裂解液+2.5ulproteinaseK