现代微生物遗传学第四授课单元.pptVIP

第四授课单元质粒：存在于细菌、真菌等微生物细胞中、独立于染色体外、能进行自我复制的遗传因子。对于宿主，一般是非必需的通常是共价(covalent)、闭合(closed)、环状(circular)双链DNA.(但也有例外：线状DNA，RNA)附加体：整合在染色体上，或游离，并能携带宿主的染色体基因。F质粒(1946年)，第一个被发现的质粒0120世纪50-70年代：抗性质粒的大量研究，以及其他质粒的发现0220世纪70年代后，质粒广泛应用于遗传工程和分子生物学研究中。03质粒的发现二、质粒的命名原则最初发现的质粒由研究者根据表型、大小等特征自行命名。(F因子、R质粒、Col质粒等)1976年Novick提出了质粒命名原则：质粒名称一般由三个英文字母及编号组成；第一个字母一律小写p表示（plasmid）后两个字母要大写，可以采用发现者人名、实验室名称、表型性状或其他特征的英文缩写。编号为阿拉伯数字，用于区分同一类型的不同质粒。(pUC18,pUC19等)大多数质粒均控制着宿主细胞的一种或几种特殊性状，具有一定的表型，质粒可依据其表型不同可划分为以下几类：致育质粒抗药性质粒组成：转移区和抗性决定子抗药的机制：改变抗生素作用的靶点；修饰抗生素；组织抗生素进入；产生一种酶能代替宿主细胞中被抗生素作用的靶点。3.产生抗生素的质粒细菌素：细菌产生的一般只能抑制或杀死种内不同亚种或菌株中敏感细菌的特殊多肽类代谢产物。Col质粒：10种，有非接合型和接合型之分。4.产生毒性的质粒(BT)5.降解质粒：假单胞菌属是一类能广泛利用有机化合物进行生长的细菌。其体内含有大量的降解质粒。6.致病性质粒：根癌土壤农杆菌的Ti质粒；以及破伤风梭菌、肉毒梭菌和大肠杆菌等都存在致病性质粒。7.共生固氮质粒根瘤菌普遍喊有该类质粒。包括共生质粒和非共生质粒，非共生质粒对共生作用可有正或负的调节作用。8.隐蔽质粒(crypticplasmid)酵母的2?m质粒（p171）长为2?m的6kb的环状双链DNA分子位于酵母细胞核内，50~100拷贝只携带与复制和重组有关的4个基因，无遗传表型质粒上有两个600bp长的IR，被一个2.7kb区域和一个2.3kb小区域所间隔两个IR上都有一个专一重组位点(FRT)，经过重组，可使质粒互变异构成A型和B型。检测质粒的方法主要根据质粒的（遗传学特性）和（分子结构特性）。遗传特性：独特的表型、转移、人为消除等。分子结构：cccDNA和染色体相比对理化因子有更强的抗性。一、质粒消除（理化因子和生物学方法）理化因子消除法消除剂：吖啶类，EB，某些抗生素，高温，UV等如何判断某一遗传性状的丧失是质粒消除的结果还是染色体基因突变的结果呢？回复突变情况突变率理化因子消除质粒的作用机制：对质粒本身的复制和分离产生抑制作用，在生长中被淘汰选择性抑制带有质粒的菌的生长。原生质体消除法使待消除质粒的菌株在一定条件下形成原生质体，在再生后生长的菌株中可出现高频率质粒消除菌。将质粒导入已经消除了该质粒的原宿主细胞，比较导入前后表型性状的差异或恢复程度。二、遗传转移在初步确定某菌株可能含有质粒的情况下，利用已知表型性状的基因片段作探针进行分子杂交，来检测其菌株是否含有该种质粒。三、分子杂交四、质粒的分离、检测与纯化质粒分离方法：碱变性法菌体的培养和收集溶菌碱变性处理离心分离有时为了快速提取质粒DNA，可以在提取液碱变性后，用pH4.8的醋酸钠高盐缓冲液调节pH到中性，这时染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，而即使变性的质粒可以恢复到原来的构型，再通过离心，这样可以缩短提取质粒的时间。电镜观察氯化铯-EB密度梯度离心琼脂糖凝胶电泳(质粒3种构型泳动速度不同，琼脂糖浓度，EB染色，分子量的判断)纯化和检测方法一、质粒的大小和拷贝数1.大小测定表示方式：MD或kb，1MD的双链DNA≈1.65kb。测定方法：电泳、电镜、测序。大小范围：1~200kb，个别800~1000。2.质粒的拷贝数严紧型质粒(stringentplasmid)或低拷贝质粒；松弛型质粒(relaxedplasmid)或高拷贝质粒。（氯霉素可抑制细胞分离，终止染色体复制，但松弛型质粒可持续复制，其拷贝数可达到1000~3000）。质粒的复制质粒复制的方式(P120)质粒的复制起点称为oriV,大肠杆菌为oriC。复制主要通过?型复制和滚环复制之一进行。其中以?型复制为主（包括单向和双向）。质粒只编码一种或少数几种与复制有关的蛋白质，其他复制蛋白都来自宿主。pBR322质粒：pMB1的ori和rop（ROP