实验项目二住骨髓间充质干细胞的倍增时间与生长曲线的测定.pdf

PMSCs生长曲线和倍增时间的测定

【1】来自猪脂肪间充质干细胞的分离培养及其成脂分化：

取生长状况良好的P1、P3、P5、P9代细胞，用0.25％胰酶消化液,在37℃消化1-3min，

4

制成单细胞悬液,然后以5x10个/ml密度接种到30个直径为35mm培养皿中,随机分

成10组,每组3皿，每天检测一组中每皿的细胞总数，取3个皿的均值,如此至第10

组结束,细胞技术如下(2004,司徒镇强）即一天消化3个组，共消化10天.P1，P3,P5,P9

均如此,每代30个皿,共计120个皿.

细胞群体倍增时间（PDT）=（t—t）lg2/(lgN-lgN)t培养起始时间，t,培养终止时

0t00

间；N培养初始细胞数，N培养终止细胞数。

0t

【2】增强型绿色荧光蛋白转染猪骨髓间充质干细胞特性观察

5

用0.25％胰酶将转染后的细胞克隆消化为单个细胞，用PBS洗2遍，1x10个细胞加

入75μl破膜剂，振荡10s,加入PI染料700μl,室温避30min,上机检测；选同期培养的为

转染细胞为对照组，比较EGF转染对细胞增殖的影响,分别计算出静止期G/G,增殖期S%，

01

和G/M

2

【3】两种方法分离小型猪骨髓间充质干细胞的比较

3

分别取两组0，1,3代细胞，制成1x10的细胞悬液,接种到96孔板，每孔细胞悬液200

微升，置37℃、5％CO2饱和湿度孵箱内孵育，各组每24小时分别取出4孔，每孔加入MTT

（2mg/ml)20微升37℃孵育，4h后吸弃孔内培养液，每孔加入150微升分析纯的二甲基亚

砜，移至酶联免疫检测仪上振荡10min，用分度计在492nm波长处测定每孔的吸光度

值（OD492),以OD（492）值为纵坐标,时间为横坐标绘制生长曲线.

【4】人骨髓间充质干细胞体外培养及其生物学特性研究

4

取不同代数细胞,调整细胞浓度为2x10/ml后,接种于96孔培养板，置37℃，5%CO2，

饱和湿度培养箱培养后，用胰酶-EDTA进行消化，用台盼蓝拒染法计数活细胞,每天取12复

孔,共7天；根据计数结果绘制细胞生长曲线。记录测得的结果，即培养潜伏期持续多长时

间（12—24h），多长时间进入对数生长期（3天后），对数增殖期持续时间（3—5天），铺满

皿底所需时间(5—7天），细胞进入平台期多长时间及持续多长时间,停止生长时间。

【5】来自；山羊骨髓间充质干细胞体外分离与培养，

选择P1，P5，P9(即早、中、晚三代)作生长曲线，进行观察，记录各自的潜伏期,

对数生长期，平台期

山羊BMSC原代培养生长曲线绘制。

山羊BMSCP1、P5、P9代生长曲线。

【6】来自:胎猪骨髓间充质干细胞核移植及核移植胚胎干细胞的分离

将传至第4代生长旺盛pFMSCs（porcinefetalmesenchymalstemcells）细胞用0.25%

胰酶+0.04％EDTA(称取胰蛋白酶0.5g和EDTA0.08g，溶200mlPBS中，常温磁力搅拌器

搅拌直至彻底溶解，用0。22μm孔径的滤膜过滤，无菌条件分