荧光定量核酸检测技术.ppt

由于PCR具有敏感性高、特异性强等优点，适用于淋病的快速诊断和流行病学调查。利用PCR可以帮助解决的主要问题有：（1）对分离培养的菌株进行鉴定和进一步分析。（2）提高检测临床标本的阳性率和准确性。（3）用于抗生素治疗的疗效观察。（4）对淋球菌菌株进行分子流行病学分析。第31页，共36页，星期日，2025年，2月5日沙眼衣原体（CT）的核酸检测标本取材：同淋球菌在非淋性尿道炎中，由衣原体引起的占50%以上，健康人群约有10%感染率。诊断方法：（1）细胞培养繁琐、费时，且培养条件不适、标本运送不当、标本不足等因素均可影响检测敏感度。（2）免疫荧光法、酶联免疫法简便快速，但灵敏度和特异性均低于培养法。第32页，共36页，星期日，2025年，2月5日应用PCR检测方法灵敏度、特异性可达94~100%，可做为临床上各种衣原体感染标本检测的实用方法，尤其适用于衣原体感染的早期诊断及无症状携带者的检查。第33页，共36页，星期日，2025年，2月5日解脲支原体（UU）的核酸检测标本取材：同淋球菌非淋性尿道炎约20~30%由UU引起。据报到男性不育患者精液中，UU检出率高达66.6%。检出率随精子活动力下降而升高。认为UU感染可能与男性不育有关。诊断方法：（1）UU难以分离，培养需特殊培养基，操作费时，一般需1~3天才能得到初步结果。（2）血清学检查，仅10%UU尿道炎患者在病程中特异性抗体滴度升高4倍。因此PCR鉴定解脲支原体具有较高应用价值。第34页，共36页，星期日，2025年，2月5日结核杆菌（TB）的核酸检测标本取材：1、对肺结核的可疑患者，留取清晨第一口痰液。2、有血尿或脓尿，疑肾和膀胱结核的患者收集尿液。3、结核性胸膜炎、腹膜炎，由专科医生收集胸水或腹水。4、鞘膜积液由专科医生抽取送检。5、结核性脑膜炎可疑患者，抽取脑脊液送检。6、肠结核患者收集带粘液的粪便送检。检测方法：1、涂片染色镜检阳性率低，要每毫升痰中有10万个结核菌以上才能检出。第35页，共36页，星期日，2025年，2月5日关于荧光定量核酸检测技术第1页，共36页，星期日，2025年，2月5日主要表现为PCR产物分析手段落后：琼脂糖凝胶电泳法只能判断产物片段大小，并不能鉴别产物特异性。造成传统PCR检测缺点非特异性难以判断、假阳性多和重复性差等。实验室管理制度落后；人员培训水平落后；国内PCR市场存在的问题第2页，共36页，星期日，2025年，2月5日反相膜杂交技术复星微孔板杂交技术复星、华美、复华、浩源、锦宏荧光PCR技术复星、达安、匹基国内发展的核酸检测新技术第3页，共36页，星期日，2025年，2月5日反相膜杂交技术原理首先将特异性探针交联在固相载体膜上，这时载体膜以及膜上的探针相当于固定相，当膜条的一端与带有杂交反应物的液面接触时，带有生物素标记的基因片段、标记酶、酶底物依次通过这个固定点时，其表现的效应行为类似于过滤或者是亲和层析，这时探针有机会与流动相中的靶序列充分作用特异性结合（杂交），再经过酶显色最终显示出蓝紫色斑点。第4页，共36页，星期日，2025年，2月5日反相膜杂交原理示意图第5页，共36页，星期日，2025年，2月5日主要优点：1.操作简便；2.无特殊设备要求；3.适合于分型；4.结果可原始保存。主要缺点：只能进行半定量操作第6页，共36页，星期日，2025年，2月5日微孔板杂交技术原理具体来讲，用生物素（Biotin）标记的PCR扩增产物，与固定在酶标板上的链霉亲合素（Streptavidin，SA）结合，再与抗原标记的特异性HBV探针进行正向法杂交。产物通过探针连接的抗体酶识别基团和标记碱性磷酸酶的抗体特异结合后，酶催化底物，在酶标板中显出颜色，通过酶标仪读取光吸收值。第7页，共36页，星期日，2025年，2月5日微孔板杂交技术原理示意图第8页，共36页，星期日，2025年，2月5日主要优点：1.杂交部分操作类似于ELISA，实验人员较熟悉；2.可向全自动过度；3.可定量操作。主要缺点：1.分型困难；2.试剂成本较高；3.操作较复杂。第9页