摇瓶种子的制备及菌种的保藏.pptVIP

b.从浸没培养物制备菌悬液：0.5～lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；将所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。01控速冷冻02将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；03将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；04以1～2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)；05补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度达-50℃；将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相(-156℃)中保存。如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1～0.2ml(约4、8滴)转接入琼脂斜面上。迅速将安瓿置于37～40℃水浴中，并轻轻摇动以加速解；从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；复苏冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。4.冻干保藏培养物的冻干过程主题二摇瓶种子的制备及菌种的保藏

带图象分析系统的微生物菌种

显微观察装置STEP1STEP2STEP3将斜面种子或米孢子接种入装在锥形摇瓶(又称三角摇瓶)内的液体营养培养基中，在摇床上振荡培养得到的液体种子，就叫做摇瓶种子。摇瓶种子可以在摇瓶中传代，第一代俗称“母瓶”，第二代就叫做“子瓶”。母瓶或子瓶可用于生产上种子罐的接种，也常常作为摇瓶发酵试验的种子。第三节摇瓶种子的制备工艺流程摇瓶种子的制备流程如图5—l所示。斜面种子或米孢子培养基配制分装灭菌接种恒温振荡培养摇瓶种子图5—1摇瓶种子制备的工艺流程1.摇瓶种子的制备工艺培养基配制摇瓶种子以培养具有强生长活性的营养菌体为目的，因而在配制培养基时必须全面、均衡地满足菌体生长对各种营养物质的要求，包括碳源、氮源、无机盐、生长因子等。摇瓶种子在培养过程中一般不便于调节pH，故在培养基成分的选择时还应考虑培养过程中pH的稳定，可以通过生理酸、碱性物质的平衡搭配及加入磷酸盐、碳酸钙之类缓冲剂来实现。12345灭菌结束后要缓慢降压，以免培养基暴沸冲湿塞子。分装培养基的三角摇瓶用棉塞或泡沫塑料塞口，置高压蒸汽锅内灭菌。接种摇瓶种子的接种一般采用斜面种子挖块法或米孢子粒计数接人法。这种接种法难于掌握一致的接种量，可能影响摇瓶种子质量的稳定。对接种量敏感的菌种，最好采用悬液接种法，即用无茵蒸馏水将斜面种子或米孢子粒上的细胞或孢子洗下，制成细胞或抱子悬液，然后按一定体积或一定细胞(孢子)数接种至摇瓶种子培养基中。摇瓶种子在恒温室内的摇床上进行培养。摇床分旋转式和往复式两种。1抗生素工厂常用的是旋转式。2这种摇床由于主动轴和从动轴之间有一个偏心距(一般为25～50mm)，从向而旋转中产生振荡作用，以利于培养时气体交换。3为了使摇瓶中的水分蒸发量保持稳定，恒温室也应控制一定的湿度。4培养摇瓶种子应当在培养成熟后立即使用。如果暂时不用，可置4℃冰箱中保存，保存期最好不超过3d。1经过保存的摇瓶种子一般不用做生产种子，可用于摇瓶发酵实验或小型发酵罐实验。2保存STEP1STEP2STEP3摇瓶种子是液体培养的种子，在质量的控制方面，除了保证不污染杂菌及生产能力高这类与固体培养种子相同的一般标准外，还有其特殊标准。菌体浓度菌体生长阶段2．摇瓶种子的质量标准摇瓶种子以培养强生命力的营养菌体为目的，因而优良的摇瓶种子，首先要有一定的活菌体量。在一定的体积接种之下，活菌量越多，意味着至下一级种子的接种量越大，下一级种子的生长就越快，生长质量一般也越好。菌体浓度也不能太高，否则将影响摇瓶中的混合和气体交换，降低菌体生长质量。(1)菌体浓度为了使摇瓶种子有较强的生长活力，同时又满足上述达到较高菌体浓度的要求，应将摇瓶种子的菌体生长阶段控制在对数生长的后期。01这一菌体生长阶段