现代分子诊断技术.pptVIP

PCR技术也会产生假阳性新扩增的目的DNA特异性不强;退火温度过低;模板中杂质的污染。假阴性存在Taq酶的抑制剂；模板量过少；模板DNA纯度不够。原位PCR(insituPCR,ISPCR)在细胞或细胞切片上对待测的低拷贝数基因进行扩增，并通过原位杂交进行检测。不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织细胞中定位。030102将荧光素酶基因引入到噬菌体的基因组，然后用转基因噬菌体去侵染待测样品。01噬菌体侵染该宿主菌，大量合成包括荧光素酶在内的由噬菌体基因编码的蛋白，向体系中加入荧光素和ATP，就会有荧光产生。02结核菌的检测03抗药性菌株的检测04噬菌体介导细菌检测荧光素酶荧光素＋ATP荧光利用宿主细胞转录、翻译噬菌体基因荧光素酶基因宿主细菌噬菌体介导的细菌检测第三节DNA指纹DNA指纹是指对待测样品中的DNA进行分析所得到的具有特征性的DNA分子杂交图谱。DNA酶解电泳转膜杂交最常用的DNA探针是微卫星序列。受害者血样犯罪嫌疑人衣物上血样犯罪嫌疑人血样无需构建核基因库，或进行Southern杂交等复杂操作；一套引物可用于各种不同的核DNA；整个过程可以实现自动化。优点：第四节随机扩增多态DNAPCR－酶解鉴定PCR／OLA鉴定PCR-ELISA检测同一基因中多个不同位点的突变的检测第五节遗传性疾病的分子诊断技术典型的单基因遗传性疾病血红蛋白的β链（β珠蛋白）的第六个氨基酸Glu发生突变成Val。镰刀形细胞贫血症(sickle-cellanemia)血红蛋白?-链上谷氨酸变成缬氨酸第六章现代分子诊断技术酶联免疫吸附测定DNA诊断系统DNA指纹随机扩增多态DNA遗传性疾病的分子诊断技术先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的生理学特性；01确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌，还是其他物质。02实践证明:比较有效,检测到病原微生物相对比较特异；03诊断成本高、速度慢、效率低。04如砂眼衣原体、朊病毒05传统的诊断程序现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分子生物学的方法对病原物质进行诊断检测。一种有效的诊断方法应具备：专一性（specificity）强，诊断只对某一种病原菌分子产生阳性反应；灵敏度(sensitivity)高；操作简单(simplicity).0102前景:2000年,DNA诊断试剂全球销售额达到6亿美元;2004年,销售额将达到20亿美元;分子诊断的其他部门销售额以每年5％－10％的速度增长;现代分子诊断试剂的生产和销售已成为现代生物技术中利润很高的一项行业.抗体高度特异地与抗原分子结合通过抗原-抗体的特异识别反应进行检测酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbantassay,ELISA)第一节酶联免疫吸附测定工作原理：主要是利用了一抗与目标分子的特异性结合。假定目标分子是一种蛋白质，那么要得到可用于检测的抗体，则首先需要纯化出这种蛋白质，然后用纯化的蛋白质免疫动物（一般是兔子），在免疫过程中兔子的血清就会产生多克隆抗体。0102酶联免疫吸附测定的原理01将待测样品结合在固相支持物（如96孔的微量滴定板）上；02加入可以与目标分子特异反应的抗体，即一抗（primaryantibody）,反应后冲洗，将未结合上的一抗洗去；03加入二抗（secondaryantibody）。二抗通常只特异的识别一抗，而不识别目标分子（二抗上还连着一种酶，如碱性磷酸酶、过氧化物酶或脲酶等，这些酶都能够催化一种化学反应将无色底物转变成有色物质），一抗与二抗反应完成后，再次冲洗将未与一抗结合的二抗洗去。04加入无色底物。检测过程：ELISA程序和结果只结合抗原上某一单一位置单克隆抗体特异性强使用多克隆抗体的缺点同一抗体混合物中不同抗体的含量会有差异，而且每次制备的抗体的量之间也会有差异。无法区别相类似的目标分子：如果病原分子与非病原分子之间只相差一个抗原决定簇，这时多克隆抗体就无法区分，因为在ELISA检测中都会发生颜色变化。01仅凭ELISA结果容易造成误诊，ELISA检测只能作为一种初步的检测手段，要进一步确诊还必须进行western检测。02要提高ELISA检测的准确度,就必须提高一抗的特异性。03在使用抗体时，要求其抗原的编码其目标识别位点的基因要表达，而且目标位点不能够以任何方式被覆盖或阻断，否则都将影响抗体与抗原的结合。酶联免疫吸附测定的局限性第二节DNA诊断系统DNA诊断的理论基础：