PCR核酸扩增仪徐文鑫课件.ppt

二、仪器分类4.荧光定量PCR仪：结果分析二、仪器分类基线就是扩增曲线中的水平部分。在反应最初阶段，虽然产物是指数级增长，但是由于总量太少，其荧光处于背景水平，检测不到荧光增加。然而当累积了足够的扩增产物，足以产生可检测的荧光信号时，这个信号的值就被称为阈值。通常阈值默认为基线信号的标准偏差×10。在阈值的前后，PCR的反应仍然是指数级增长的，因此此时的PCR结果可靠，可以准确地反映体系中模板的初始量。Ct值是信号强度达到阈值时所需要的循环数，也就是扩增曲线与阈值的交叉点。二、仪器分类*****************PCR核酸扩增仪徐文鑫聚合酶链反应（PCR）技术是生物医学的一项革命性创举，推动了现代医学由细胞水平向分子水平、基因水平的发展，成为现代分子生物学领域不可缺少的实验技术。

采用PCR方法进行核酸扩增的仪器叫做PCR核酸扩增仪，简称PCR仪。1988年世界上第一台PCR仪推出。当今，实时荧光定量PCR仪以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为分子生物学领域的重要工具。临床应用：

感染性疾病的分子诊断和研究

遗传性疾病的分子诊断和研究

恶性肿瘤的分子诊断和研究

在移植配型中的应用

在法医学和卫生安全中的应用一、技术原理加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板DNA杂交，在TaqDNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物，重复“变性→退火→引物延伸”过程至25～40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。一、技术原理PCR循环

第一步：加热变性加热至93度左右并保温一段时间，DNA解开螺旋成为两种DNA单链一、技术原理Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环

第二步：退火（复性）温度降至55度左右后复性。引物按碱基序列互补配对原则结合到模板链上。一、技术原理Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerasePCR循环

第三步：引物延伸引物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，Mg2+和合适pH条件下，按碱基配对原则与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的新链。一、技术原理第1个PCR循环完成后

——得到两个拷贝的靶序列一、技术原理30次循环后靶序列扩增的数量一、技术原理30次循环后靶序列扩增的数量一、工作原理PCR核酸扩增仪的工作关键是：温度控制控温方式水浴锅控温压缩机控温半导体控温离心式空气加热控温二、仪器分类1.普通PCR仪：只能运行一个特定退火温度。对单一退火温度的目的基因进行扩增。2.梯度PCR仪：可以设置一系列不同的退火温度条件，通常为12种温度梯度。研究未知DNA退火温度的扩增。3.原位PCR仪：将具有细胞定位能力的原位杂交技术应用于从细胞内靶DNA的定位分析，在细胞内实现基因扩增，不仅可以检测到靶基因，还能标出DNA在细胞内的位置。二、仪器分类4.荧光定量PCR仪：在普通PCR仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统。*****************