生物化学蛋白质.ppt

第21页，共72页，星期日，2025年，2月5日第22页，共72页，星期日，2025年，2月5日三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（一）蛋白质的胶体性质大小在1-100nm范围内；同种电荷互相排斥；质点外围有水化层。（二）蛋白质的沉淀1.盐析法2.有机溶剂沉淀法3.重金属盐沉淀法4.生物碱试剂和某些酸类沉淀法5.加热变性沉淀法第23页，共72页，星期日，2025年，2月5日四、蛋白质分离纯化的一般原则1.前处理要选择合适的材料;合适的破碎方法;合适的提取液。2.粗分级分离要方法简便，处理量大。常用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法，有时可用超过滤或凝胶过滤等方法。3.细分级分离主要使用各种层析、电泳，方法要精心选择，巧妙配合。后期可用结晶法。第24页，共72页，星期日，2025年，2月5日五、蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法1.透析和超滤(1)透析透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止。原理：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。第25页，共72页，星期日，2025年，2月5日第26页，共72页，星期日，2025年，2月5日(2).超滤：利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。超滤是一种膜分离技术第27页，共72页，星期日，2025年，2月5日第28页，共72页，星期日，2025年，2月5日2.密度梯度离心第29页，共72页，星期日，2025年，2月5日第30页，共72页，星期日，2025年，2月5日3.凝胶过滤第31页，共72页，星期日，2025年，2月5日(二)利用溶解度差别的纯化方法1.等电点沉淀和pH控制利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。第32页，共72页，星期日，2025年，2月5日在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节pH的过程中，要一边搅拌一边慢慢加入，以防止局部过酸或过碱。第33页，共72页，星期日，2025年，2月5日2.蛋白质的盐溶和盐析定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚积并从溶液中析出。第34页，共72页，星期日，2025年，2月5日第35页，共72页，星期日，2025年，2月5日盐的选择：蛋白质的盐析通常采用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最广的是硫酸铵。硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好稳定作用。又因为其离子容积较大，吸走水分子的能力也大，成为有效的盐析工具。第36页，共72页，星期日，2025年，2月5日硫酸铵浓度的计算与调整方法通常硫酸銨的添加以百分饱和度來表示(不是浓度百分比)，例如大部分蛋白质可在80%硫酸銨饱和度下沉淀。因为硫酸銨加入的体积很大，会改变最后的总体积，很难由浓度百分比來计算，因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度量。第37页，共72页，星期日，2025年，2月5日用硫酸铵进行盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法主要有二种：（1）加入饱和溶液法要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高V=V0(S2-S1)/（1-S2）V:所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V0:原溶液的体积；S2：所需达到的硫酸铵饱和度；S1:原溶液的硫酸铵饱和度。饱和硫酸铵的配制方法：在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至50－60℃，趁热滤去沉淀，再在0℃或室温平衡1－2天，有固体析出时达100％饱和度。第38